水稻OsNCED1基因功能的初步研究.pdf

1、水稻是我國(guó)主要的糧食作物，其一生中可能會(huì)受到冷、熱、干旱等各種逆境影響。脫落酸是一種重要的植物激素，除了調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育外，它在響應(yīng)植物各種各樣的生物脅迫、非生物脅迫中起著關(guān)鍵的作用。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是ABA生物合成的關(guān)鍵限速酶，本研究以水稻粳稻日本晴和秈稻E007為材料，利用CRISP-Cas9、基因過(guò)表達(dá)和組織化學(xué)定位GUS等分子生物學(xué)和植物生理等技術(shù)方法研究水稻OsNCED1基因響應(yīng)各種非生物脅迫的生理

2、機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1、獲得Osnced1敲除突變體純合體植株。以O(shè)sNCED1的CDS序列設(shè)計(jì)基因編輯靶位點(diǎn)，構(gòu)建OsNCED1-Cas9基因敲除載體，轉(zhuǎn)化日本晴和秈稻E007獲得Osnced1基因敲除純合體植株。對(duì)純合體植株進(jìn)行敲除位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)以日本晴為外植體的Osnced1基因敲除純合體株系在基因組928bp處缺失了1個(gè)堿基;秈稻的兩株Osnced1基因敲除純合體分別有1個(gè)堿基的缺失和增添。
　　2、Osnce

3、d1敲除突變體對(duì)鹽脅迫敏感。Osnced1敲除突變體在幼苗期和三葉期對(duì)鹽脅迫敏感。幼苗期進(jìn)行不同濃度鹽脅迫，結(jié)果都顯示突變體較野生型生長(zhǎng)明顯較慢。三葉期進(jìn)行150mM NaCl處理，Osnced1敲除突變體幼苗的存活率為0％，野生型的存活率為20％，表明Osnced1敲除突變體鹽脅迫能力下降。
　　3、低溫脅迫下Osnced1敲除突變體結(jié)實(shí)率降低。采用分期播種的方法使突變體在開花期經(jīng)歷自然低溫，結(jié)果表明敲除突變體結(jié)實(shí)率明顯低于野生

4、型。在開花期進(jìn)行18℃低溫處理7天，Osnced1敲除突變體結(jié)實(shí)率較野生型明顯下降，其結(jié)實(shí)率為50.99％，而野生型為75.71％，人工低溫處理的結(jié)果與自然低溫脅迫下結(jié)實(shí)率一致。表明Osnced1敲除突變體開花期耐低溫的能力下降。
　　4、過(guò)表達(dá)OsNCED1提高了水稻開花期耐低溫的能力。對(duì)OsNCED1基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，PCR鑒定發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中OsNCED1基因表達(dá)明顯上調(diào)。在開花期對(duì)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行18

5、℃低溫脅迫處理7天，OsNCED1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因苗結(jié)實(shí)率為85.22％，野生型結(jié)實(shí)率為75.71％。過(guò)表達(dá)OsNCED1能提高水稻開花期耐低溫的能力。
　　5、OsNCED1基因在水稻的根、胚芽鞘、葉、莖、節(jié)、穎殼中均有表達(dá)。構(gòu)建Pro:NCED1∷GUS載體，獲得NCED1-GUS轉(zhuǎn)基因植株，GUS組織染色顯示OsNCED1在根、胚芽鞘、葉、莖、節(jié)、穎殼有特異性表達(dá)。OsNCED1半定量分析呈現(xiàn)與GUS組織染色一致的結(jié)果，OsNC