納米級(jí)對(duì)氨基苯胂酸微粒對(duì)斷奶仔豬的抗菌促生長(zhǎng)效果及其機(jī)理研究.pdf

1、本課題以納米級(jí)對(duì)氨基苯胂酸微粒(p-ASAP)為抗菌材料，用對(duì)氨基苯胂酸(p-ASA)為對(duì)照，在體外細(xì)菌培養(yǎng)條件下探討其抗菌活力及其機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，以30日齡“杜大長(zhǎng)”三元雜交斷奶仔豬為試驗(yàn)動(dòng)物，研究了p-ASAP對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉率、腸道結(jié)構(gòu)功能、腸道微生物變化和組織器官砷殘留的影響。 體外抗菌試驗(yàn)以大腸桿菌Escherichia coli；豬霍亂沙門(mén)氏菌Salmonellachloleraesuis；金黃色葡萄球菌S

2、taphylococcus aureus，嗜酸乳酸桿菌Lactobacillusacidophilus和兩歧雙歧桿菌Bffidobacterium bifidum為試驗(yàn)菌種，抗菌效果測(cè)定方法采用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的在體外對(duì)需氧型細(xì)菌及厭氧型細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的方法。眼觀無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度MIC：將所有清晰、無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的試管培養(yǎng)液接種于MH瓊脂平板培養(yǎng)，以菌落數(shù)不超過(guò)5個(gè)的最低藥物濃度為該藥物的MBC；

3、采用微生物黏著碳?xì)浠衔锓y(cè)定p-ASAP對(duì)大腸桿菌表面疏水性的影響；并在原子力顯微鏡下觀察p-ASAP對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌Salmonella chloleraesuis結(jié)構(gòu)、形態(tài)方面變化的影響，探討殺菌機(jī)理。 飼養(yǎng)試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇216頭(體重7.0±0.40 kg)杜長(zhǎng)大三元雜交斷奶仔豬，按飼養(yǎng)試驗(yàn)要求分成6組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12頭(公母各半)，試驗(yàn)豬分別飼喂基礎(chǔ)同糧(對(duì)照1組)、基礎(chǔ)同糧+90mg/kg

4、 p-ASA(美國(guó)FDA推薦劑量，對(duì)照2組)、基礎(chǔ)R糧+10mG/kg p-ASAP(試驗(yàn)1組)、基礎(chǔ)日糧+30mg/kg p-ASAP(試驗(yàn)2組)、基礎(chǔ)同糧+60mg/kg p-ASAP(試驗(yàn)3組)、基礎(chǔ)同糧+90mg/kg p-ASAP(試驗(yàn)4組)。試驗(yàn)豬飼養(yǎng)于封閉、半漏縫地板式豬舍，每個(gè)重復(fù)仔豬飼養(yǎng)于一欄。飼喂方式采用自由采食，自由飲水。預(yù)試期5d，試驗(yàn)期35d。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束空腹稱(chēng)重后，分別從對(duì)照1、2組及試驗(yàn)組中生長(zhǎng)最佳組隨機(jī)選

5、體重相近的試驗(yàn)豬8頭(公母各半)進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。在自由飲水情況下禁食24小時(shí)后屠宰取樣，分析測(cè)定。 體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)氨基苯胂酸經(jīng)納米粒徑化處理成60nm大小的微粒后，顯著提高了它的抗菌活力，對(duì)大腸桿菌K<,88>、大腸桿菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌、嗜酸乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌的最小抑菌濃度分別達(dá)到4、4、2、2、8、和4μg/ml；最小殺菌濃度分別達(dá)到8、16、8、8、32和32μg/ml。同時(shí)發(fā)現(xiàn)p-ASAP對(duì)豬霍

6、亂沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，而且對(duì)腸道有益菌一嗜酸乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌也具有一定的殺滅作用。通過(guò)原子力顯微鏡觀察p-ASAP處理的S. choleraesuis形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌用8μg/mL p-ASAP處理30min后，細(xì)胞被P-ASAP粒子包圍，60min后細(xì)胞從圓球形變?yōu)闊o(wú)規(guī)則形狀，1.5h后變?yōu)楸馄叫螤睿瑫r(shí)細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞開(kāi)始萎縮變小，細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)物質(zhì)泄露，3h后S. chole

7、raesuis細(xì)胞分解為碎片。隨著P-ASAP濃度的增加，大腸桿菌表面疏水性顯著下降，在菌液中添加90mg/L P-ASA，大腸桿菌表面疏水性下降了38.82％(p<0.05)；添加10、30、60和90mg/L P-ASAP懸濁液，大腸桿菌表面疏水性分別下降了47.74％(p<0.05)、59.66％(p<0.05)、74.38％(p<0.01)和79.86％(p<0.01)。 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照1組相比，在斷奶仔豬日糧

8、中添加10、30、60、90mg/kgp-ASAP，R均采食量分別提高了12.0％07<0.05)、13.98％(p<0.05)、9.80％(p<0.05)和12.99％(p<0.05)：日增重分別提高了28.99％(p<0.05)、29.23％07(p<0.05)、21.13％(p<0.05)和23.58％(p<0.05)；飼料轉(zhuǎn)化率分別提高16.66％(p<0.01)、15.15％(p<0.05)、12.12％(9<0.05)和 1

9、0.6％(p<0.05)；腹瀉率分別下降52.23％(p<0.01)、65.39％(p<0.01)、58.81％(p<0.01)和64.21％(p<0.01)：試驗(yàn)組之間，30、60、90mg/kg比10mg/kgp-ASAP組腹瀉率分別下降22.76％(p<0.05)、13.17％(p<0.05)和25.06％(p<0.05)；其它指標(biāo)差異不顯著。與90mg/kg P-ASA(對(duì)照2組)相比，在斷奶仔豬月糧中添加10、30、60、90

10、mg/kgP-ASAP，腹瀉率分別下降了38.68％(p<0.05)、55.57％(p<0.05)、47.13％(p<0.05)和54.05％(p<0.05)；其它指標(biāo)差異不顯著。 消化試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照1組相比，在斷奶仔豬日糧中添加10、30、60和90mg/kgp-ASAP，日糧中干物質(zhì)消化率分別提高13.03％(p<0.05)、14.55％(p<0.05)、11.47％(p<0.05)和12.74％(p<0.05)；粗蛋

11、白消化率分別提高16.06％(p<0.05)、15.04％(p<0.05)、14.19％(p<0.05)和 14.08％(p<0.05)；粗脂肪消化率分別提高13.55％(p<0.05)、12.30％(p<0.05)、16.35％(p<0.05),114.64％(p<0.05)：粗纖維消化率分別提高18.87％(p<0.05)、20.39％(p<0.05)、24.70％(p<0.05)和19.33％(p<0.05)；與90mg/kg對(duì)氨

12、基苯胂酸相比，各指標(biāo)差異不顯著；試驗(yàn)組之間各指標(biāo)差異均不顯著。 腸道微生物培養(yǎng)分析顯示，與對(duì)照1組相比，在斷奶仔豬日糧中添加10mg/kgp-ASAP，空腸內(nèi)容物中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌數(shù)量分別下降21.23％(p<0.05)、21.18％(p<0.05)、41.63％(p<0.01)和41.01％(p<0.01)；回腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌數(shù)量分別下降17.91％(p<0.05)、20.11％

13、(p<0.05)、38.54％(p<0.01)和33.12％(p<0.01):結(jié)腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌數(shù)量分別下降13.75％(p<0.05)、14.82％(p<0.05)、33.85％(p<0.01)和30.18％(p<0.01)；與對(duì)照2組相比，空腸中大腸桿菌、沙門(mén)氏菌數(shù)量分別下降16.96％(p<0.05)和 14.69％(p<0.05)；回腸中大腸桿菌、沙門(mén)氏菌數(shù)量分別下降19.96％(p<0.05)和12.

14、39％(p<0.05)；結(jié)腸中大腸桿菌、沙門(mén)氏菌數(shù)量分別下降14.81％(p<0.05)和 7.59％(p<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明P-ASAP對(duì)斷奶仔豬腸道有害菌有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用；同時(shí)對(duì)有益菌也有一定的抑制和殺滅作用。 小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，與對(duì)照1組相比，在斷奶仔豬同糧中添加10mg/kgP-ASAP，空腸、回腸組織絨毛長(zhǎng)度分別高41.06％(p<0.01)和18.02％(p<0.05)，隱窩深度淺22.72％(p

15、<0.05)和113.82％(p<0.05)；絨毛高度和隱窩深度比值提高82.60％(p<0.01)和37.14％(p<0.01)；十二指腸絨毛長(zhǎng)度和絨毛高度和隱窩深度比值有提高趨勢(shì)，隱窩深度有下降趨勢(shì)；與對(duì)照2組相比，空腸組織絨毛高度高20.0％(p<0.05)，絨毛高度和隱窩深度比值提高29.89％(p<0.05)；隱窩深度無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在同糧中添加P-ASAP可以減輕仔豬因斷奶所致的小腸絨毛萎縮和隱窩加深的程度，有利于

16、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。 消化道酶活分析表明，與對(duì)照1組相比，日糧中添加添加10mg/kg p-ASAP，斷奶仔豬十二指腸內(nèi)容物中乳糖酶、淀粉酶、脂肪酶、總蛋白水解酶活性分別提高27.15％(p<0.05)、49.35％(p<0.5)、38.94％(p<0.5)和38.39％(p<0.05)；空腸粘膜二糖酶麥芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶活性分別提高55.74％(p<0.01)、47.16％(p<0.01)和63.88％(p<0.01)；與

17、對(duì)照2組相比，麥芽糖酶、蔗糖酶活性分別提高17.48％(p<0.05)、29.69％(p<0.05)；乳糖酶活性有提高趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著水平。 血清指標(biāo)分析結(jié)果表明，與對(duì)照1組相比，在日糧中添加10mg/kgp-ASAP，斷奶仔豬血清中TNF-α、IL-6和尿素氮水平下水平分別下降78.29％(p<0.01)、61.42％(p<0.01)和19.26％(p<0.05)，血清磷水平提高39.79％(p<0.01)；其它指標(biāo)差異不顯

18、著。與對(duì)照2組相比所有指標(biāo)差異不顯著。 腸道核因子測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照1組相比，在斷奶仔豬同糧中添加10mg/kgP-ASAP，空腸粘膜中核因子NF-κB活性下降68.53％(p<0.01)：與對(duì)照2組相比，下降33.33％(p<0.05)。 綜上所述，對(duì)氨基苯胂酸經(jīng)納米粒徑化處理后，顯著提高了抗菌活力：在斷奶仔豬日糧中添加低劑量(10mg/kg)p-ASAP微粒達(dá)到了高劑量(90mg/kg)p-ASA的抗菌促生長(zhǎng)效果，并