Sema3A誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞遷移及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究目的： 1、觀察Sema3A-Fc對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞遷移的影響； 2、探討cAMP-PKA、cGMP-PKG和RhoA-ROCK信號(hào)通路在Sema3A-Fc誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞遷移中的作用； 3、試圖闡明Sema3A誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞遷移中可能的信號(hào)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定在解剖顯微鏡下切取新生SD大鼠室管膜下區(qū)腦組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％小牛

2、血清和10％胎牛血清的DMEM。細(xì)胞分層時(shí)由于OPCs生長(zhǎng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞層上面，根據(jù)貼壁能力差異，采用差速振蕩法分離上層的OPCs。OPCs采用DMEM/F12培養(yǎng)基(含2％B27，20ng/LbFGF和20ng/LPDGF-AA)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。分別用無(wú)血清培養(yǎng)基和血清培養(yǎng)基對(duì)OPCs進(jìn)行促分化培養(yǎng)。分別選取少突膠質(zhì)細(xì)胞系不同發(fā)育期標(biāo)志性抗原(A285、GFAP和CNPase)，采用間接免疫熒光染色技術(shù)對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行類(lèi)型鑒定。EGF

3、P質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，挑選成功轉(zhuǎn)染GFP的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)備用。 2、表達(dá)Sema3A-Fc的COS-7細(xì)胞的制備利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建Sema3A-Fc重組質(zhì)粒，利用雙酶切、基因測(cè)序進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定；脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，G418篩選抗性克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)，免疫組化和免疫印跡法鑒定重組蛋白表達(dá)情況，獲得穩(wěn)定表達(dá)Sema3A的COS-7細(xì)胞。用含有sema3A-Fc培養(yǎng)上清加入體外培養(yǎng)的OPCs培養(yǎng)

4、瓶中，通過(guò)對(duì)比觀察構(gòu)建表達(dá)的sema3A-Fc是否具有生物學(xué)活性。并對(duì)細(xì)胞膜上NP-1受體進(jìn)行了檢測(cè)。 3、Sema3A-Fc誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞遷移信號(hào)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 1)用millicell-PCF細(xì)胞遷移小室(孔徑8um)進(jìn)行細(xì)胞遷移試驗(yàn)。將穩(wěn)定表達(dá)Sema3A-Fc的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)在遷移倉(cāng)下層，待細(xì)胞融合達(dá)70％以上后，將純化培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞按2x104/孔接種在遷移倉(cāng)的上層，共培養(yǎng)12h后，固定細(xì)

5、胞，甲苯胺藍(lán)染色，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。設(shè)對(duì)照組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)基對(duì)照和轉(zhuǎn)染pIG的COS-7對(duì)照組。 2)PKA和PKG的激活實(shí)驗(yàn)：分別加入cAMP類(lèi)似物8-溴-cAMP(濃度50μM)，cGMP類(lèi)似物8-溴-cGMP(濃度500μM)于分層遷移實(shí)驗(yàn)艙下層中，觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的遷移情況，計(jì)數(shù)并比較遷移結(jié)果。 3)PKA和PKG抑制實(shí)驗(yàn)：分別加入PKA的特異性抑制物KT5720(濃度10μM)和PKG的特異性抑制物KT5823

6、(濃度1μM)于分層遷移實(shí)驗(yàn)艙下層中，觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的遷移情況，計(jì)數(shù)并比較遷移結(jié)果。 4)抑制Rock激酶試驗(yàn)：分別在上述實(shí)驗(yàn)組中加入有Rho活性的ROCK激酶抑制物Y27632(濃度10μM)，分別觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的遷移情況，計(jì)數(shù)并比較遷移結(jié)果。 5)免疫熒光法檢測(cè)PKAα催化亞基和PKG1含量：分別用小鼠抗PKAα催化亞基抗體和兔抗PKG1抗體做為一抗，PBS替代-抗作陰性對(duì)照，在相同條件下進(jìn)行免疫熒光

7、染色和照相。用Image-ProPlus5.1圖像分析軟件，對(duì)圖像進(jìn)行分析處理。 6)觀察PKG，PKA和ROCK活性對(duì)OPCs細(xì)胞遷移的直接作用。在沒(méi)有sema3A-Fc存在的情況下，用8-Br-cAME8-Br-cGMP,KT5720、KT5823和Y27632直接作用于OPCs細(xì)胞(濃度同前)，觀察PKG，PKA和ROCK活性改變是否對(duì)體外培養(yǎng)的OPCs細(xì)胞遷移的產(chǎn)生直接影響。 4、統(tǒng)計(jì) 定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)

8、準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩個(gè)組間的差異，使用單因素方差分析比較多個(gè)組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P＜0.01為有顯著差異。 主要結(jié)果： 1、體外成功分離培養(yǎng)出少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，A285標(biāo)記陽(yáng)性，純度達(dá)到95％以上。并能進(jìn)一步分化為CNPase標(biāo)記陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞和GFAP標(biāo)記陽(yáng)性Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2、成功構(gòu)建了pIGsema3A-

9、Fc重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切(HindⅢ和BamHⅠ)和基因測(cè)序鑒定正確，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，經(jīng)免疫組化和Western-blot檢測(cè)到重組蛋白的表達(dá)。表達(dá)Sema3A-Fc的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)上清能夠促使體外培養(yǎng)的OPCs細(xì)胞突起回縮，胞體變圓。用抗Fc抗體和抗NP-1抗體免疫熒光染色均呈膜性染色。 3、sema3A-Fc誘導(dǎo)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Sema3A-Fc實(shí)驗(yàn)組OPCs遷移數(shù)為(24.3±6.7)，單純培養(yǎng)基對(duì)照組為(38

10、.4±7.9)，轉(zhuǎn)染pIG的COS-7對(duì)照組為(37.7±8.3)，實(shí)驗(yàn)組與兩個(gè)對(duì)照組均存在明顯差異(n=15，P＜0.01)。 4、OPCs細(xì)胞內(nèi)PKG、PKA免疫組化檢測(cè)：通過(guò)針對(duì)催化亞基的抗體用免疫熒光法對(duì)細(xì)胞內(nèi)PKA和PKG進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OPCs細(xì)胞內(nèi)的PKA和PKG均有基礎(chǔ)量的表達(dá)，主要分布在胞漿和突起內(nèi)。當(dāng)加入含sema3A-Fc的培養(yǎng)上清時(shí)，細(xì)胞內(nèi)PKAα催化亞基染色強(qiáng)度沒(méi)有明顯變化，而PKG1的染色強(qiáng)度則較對(duì)照組

11、明顯增高(P＜0.01)，表明PKG含量增加，活性增強(qiáng)。表明含sema3A-Fc激活了cGMP-PKG信號(hào)通路。 5、PKA和PKG激活/抑制實(shí)驗(yàn)：OPCs遷移數(shù)分別為：8-溴-cAMP組OPCs遷移數(shù)為(32.6±7.3)較對(duì)照組(24.3±6.7)明顯增加(P＜0.01)，8-溴-cGMP組為(19.3±5.5)較對(duì)照組(24.3±6.7)有減少明顯(P＜0.05)。PKA和PKG抑制實(shí)驗(yàn)：OPCs遷移數(shù)分別為：KT5720

12、組(17.5±5.3)較對(duì)照組(24.3±6.7)明顯減少(P＜0.01)。KT5823組(29.9±6.2)較對(duì)照組(24.3±6.7)有明顯增加(P＜0.05)。表明PKG通路對(duì)sema3A信號(hào)具有正向調(diào)節(jié)作用，而PKA通路則具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。 6、抑制ROCK激酶試驗(yàn)：Y27632干預(yù)前后的成對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為，對(duì)照組(37.7±8.3)對(duì)(38.4±8.2)，sema3A-Fc組(24.3±6.7)對(duì)(35.3±8.7)

13、，8-溴-cAMP組(32.6±7.3)對(duì)(32.4±7.6)，8-溴-cGMP組(19.3±5.5)對(duì)(29.9±6.2)，KT5720組(17.5±5.3)對(duì)(26.5±5.7)，KT5823組(29.9±6.2)對(duì)(36.9±7.7)。單因素方差分析示組間有明顯差異(P=0.012)。表明ROCK激酶抑制劑Y27632能明顯抑制sema3A-Fc對(duì)OPCs細(xì)胞遷移的作用，間接證明Sema3A激活了OPCs細(xì)胞內(nèi)的Rho-ROCK信

14、號(hào)通路。 7、在去除Sema3A-Fc情況，單獨(dú)應(yīng)用8-Br-cGMP、8-Br-cAMP、KT5720、KT5823和Y27632并不能改變OPCs原有的遷移能力。結(jié)果為：8-溴-cAMP組(36.8±7.1)，8-溴-cGMP組(35.1±7.4)，KT5720組(37.5±8.1)，KT5823組(34.9±7.6)，均與對(duì)照組(37.7±8.3)無(wú)明顯差異(n=15，P＞0.05)。但與sema3A-Fc存在時(shí)的數(shù)據(jù)進(jìn)行

15、配對(duì)比較則有明顯差異(P＜0.05)。 全文結(jié)論： 1、通過(guò)二次接種和差速振蕩法，成功分離出高純度少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，傳代及分化培養(yǎng)，通過(guò)免疫組化法鑒定了細(xì)胞類(lèi)型。脂質(zhì)體法成功導(dǎo)入EGFP基因，成為可示蹤的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞。 2、成功構(gòu)建了pIGsema3A-Fc真核表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，表達(dá)出具有生物活性的sema3A融合蛋白。 3、Sema3A-Fc對(duì)體外培養(yǎng)的OPCs細(xì)胞遷