分化抑制蛋白—1（Id-1）在惡性實體腫瘤誘導(dǎo)分化中的作用.pdf

1、腫瘤細胞是分化機制失控的細胞，表現(xiàn)為細胞形態(tài)改變、核漿比增大、細胞周期異常、過度增殖和某些生理功能的喪失等。有些惡性腫瘤細胞可以在體內(nèi)外某些因素的作用下被誘導(dǎo)而重新發(fā)生分化，惡性程度降低，這就是腫瘤的誘導(dǎo)分化治療。目前只有少數(shù)的誘導(dǎo)分化劑成功地用在血液系統(tǒng)腫瘤的治療上，而對實體瘤的誘導(dǎo)分化治療卻鮮有報導(dǎo)。另外，在腫瘤學(xué)研究中有一類很重要的蛋白——分化抑制蛋白(Id)，它參與了胚胎細胞的分化和腫瘤的發(fā)生、侵襲、血管形成等過程，但是作為分化

2、相關(guān)的蛋白，它在腫瘤分化中所起的作用還不明確。本研究就是以分化抑制蛋白家族中表達譜最廣的Id-1作為分子靶標，通過RNAi技術(shù)降低該蛋白的表達，來觀察該蛋白在惡性實體腫瘤誘導(dǎo)分化中的作用。 首先，本研究在體外水平上探討了Id-1蛋白在惡性腫瘤細胞誘導(dǎo)分化中的作用。本實驗室曾經(jīng)用組織芯片和免疫組化的方法證明了Id-1蛋白在肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等多種腫瘤組織中表達，并且表達程度與腫瘤的分化程度呈負相關(guān)。為了進一步明確Id-1蛋

3、白在腫瘤分化中的作用，我們采用了即可以形成實體腫瘤，又有明確分化標志，還高表達Id-1蛋白的小鼠樹突狀細胞肉瘤(DCS)細胞作為體外模型，通過RNAi的方式降低該細胞中Id-1蛋白的表達并觀察干擾后細胞的變化。我們設(shè)計并化學(xué)合成了三條針對小鼠Id-1 mRNA的小干擾RNA(siRNA)，經(jīng)陽離子脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染DCS細胞，Western Bloting篩選出50nM的siNM_010495_001號siRNA在轉(zhuǎn)染后12～16h對Id

4、-1蛋白的抑制效果可達90％以上，并通過Real-time PCR在mRNA水平上進行了驗證。 確定DCS細胞內(nèi)Id-1蛋白的表達被抑制后，我們檢測該細胞在生物學(xué)特征、分化特性和惡性行為上的改變，同時設(shè)立了空白組和無關(guān)對照組作為陰性對照，誘導(dǎo)分化劑丁酸鈉組作為陽性對照。降低Id-1蛋白的表達后，在生物學(xué)特征上DCS細胞展現(xiàn)出趨向成熟樹突狀細胞的形態(tài)：細胞伸展，分枝增多、變長；細胞體積增大，核漿比減??；細胞周期也發(fā)生了顯著變化，干

5、擾后24h處于G<,0>/G<,1>期的細胞由13.6％上升至26.8％，S期細胞由77.9％下降至63.9％；干擾后48hG<,0>/G<,1>期的細胞由40.2％上升至50.4％，S期細胞由37.9％下降至27.6％，P<0.01。在分化特性上，干擾DCS細胞中Id-1基因的表達后，DCS細胞出現(xiàn)了分化成熟的標志，表現(xiàn)在樹突狀細胞的分化標志Id-2蛋白表達增高，并且DC細胞成熟的標志CD86由干擾前的陰性變?yōu)殛栃浴Ｎ覀冞€分別通過MT

6、T實驗、克隆形成實驗和Transwell實驗證明了干擾Id-1基因表達后DCS細胞體外增殖能力、成瘤能力和侵襲能力都降低了(P<0.01)。以上結(jié)果證明降低Id-1的表達，可以誘導(dǎo)惡性實體腫瘤細胞發(fā)生分化，降低其惡性程度。此外，我們還初步探討了Id-1發(fā)揮作用的信號通路。Western Bloting結(jié)果顯示干擾Id-1基因的表達，可引起分化相關(guān)的、Id-1直接作用的下游基因E2A的表達增高，說明降低Id-1蛋白誘導(dǎo)的腫瘤細胞的分化可能

7、是通過E2A參與的信號通路如MAPK、Notch等進行的。 為進一步明確降低Id-1表達在體內(nèi)水平上對腫瘤的治療作用，我們進行了第二部分的研究。以高表達Id-1蛋白的小鼠肝癌腹水瘤(H22)為模型，將第一部分證實有效的siRNA進行甲基化修飾，用陽離子脂質(zhì)體包裹后腹腔注射治療，觀察模型小鼠在體重和腹圍上的變化來評價治療效果，同時探討RNAi體內(nèi)治療腫瘤的可行性。結(jié)果顯示，高劑量干擾組和低劑量干擾組小鼠的體重增長和腹圍增長都慢于無

8、關(guān)對照組，尤其是高劑量siRNA對小鼠腹水瘤的抑制作用明顯，相對抑制率在50％以上，與無關(guān)對照組相比，有明顯差異(P<0.05)。提示降低Id-1蛋白的表達可以有效抑制腫瘤細胞在體內(nèi)的增殖，減慢腹水的增長速度，而且這種治療效果具有劑量的依賴性。 總之，通過RNAi技術(shù)降低Id-1蛋白的表達，在體外可以誘導(dǎo)實體腫瘤細胞發(fā)生分化，細胞的增殖、成瘤、侵襲能力都降低，在體內(nèi)也能有效地抑制腹水瘤細胞的增殖，減緩腹水的產(chǎn)生速度。說明實體腫瘤