分化抑制蛋白ID和HIV-1整合酶抑制劑的結(jié)構(gòu)分子生物學研究.pdf

1、第一部分
　　目的：分化抑制蛋白（Id）家族在細胞增殖、分化、以及腫瘤發(fā)生進展過程中均有重要作用。本研究對該家族蛋白的N端序列進行保守性結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建其基因突變體。
　　方法：應(yīng)用ClustalX(1.81)軟件對Id蛋白家族中三個成員（Id1-3）的N端序列進行同源性分析；Swiss-PdbViewer3.7(SP5)軟件模擬高同源區(qū)域中關(guān)鍵性氨基酸突變前后的三維結(jié)構(gòu)模型；以PCR方法將突變點引入Id序列，通過重疊PCR方

2、法擴增出全長編碼序列；酶切與測序確證突變序列的準確性。
　　結(jié)果：Id1-3蛋白的N端存在一個由11個氨基酸形成的高度保守的旋轉(zhuǎn)-螺旋（Loop-Helix）結(jié)構(gòu)，將其中最保守的絲氨酸與亮氨酸分別突變?yōu)楦拾彼崤c纈氨酸；成功構(gòu)建包含突變Id基因序列的pGEX原核表達載體。
　　結(jié)論：本研究在Id1-3蛋白N端識別了一個保守的Loop-Helix結(jié)構(gòu)，為深入研究其協(xié)同的功能特征提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)；構(gòu)建的突變其中的絲氨酸表達載體為研究

3、Id蛋白磷酸化修飾和功能奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分
　　目的：兒茶素家族化合物作為一種毒副作用小、價格低廉的天然化合物，已顯示出對艾滋病毒的抑制效果，但其抑制機理仍不明確。本研究探討兒茶素家族化合物對于HIV-1整合酶的抑制效果，初步闡明該家族化合物對艾滋病毒的抑制機理。
　　方法：采用ELISA實驗方法檢測四種帶有沒食子?；膬翰杷貙τ贖IV-1整合酶的抑制力。將這四種兒茶素按照等比例混合，檢測它們協(xié)同抑制的效果，同時

4、選擇一種無沒食子酰基的兒茶素EC作為對照。采用分子對接的計算機模擬方法研究沒食子酰基的兒茶素對于HIV-1整合酶的抑制機理。
　　結(jié)果：通過ELISA實驗方法，發(fā)現(xiàn)四種含有沒食子酰基的兒茶素，包括Catechingallate(CG)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG），Gallocatechingallate(GCG)，和表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechingallate,

5、ECG）對HIV-1整合酶有顯著的抑制效果。通過分子對接的研究發(fā)現(xiàn)，當HIV-1整合酶沒有結(jié)合病毒DNA的時候，這四種兒茶素會結(jié)合在Tyr143和Gln148氨基酸上，因此改變了整合酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Gly140-Gly149）的柔韌性，從而降低了整合酶的活性。此外，當整合酶與病毒DNA結(jié)合上之后，這四種兒茶素可以結(jié)合在整合酶與病毒DNA之間，從而干擾其整合效率。并且，這四種兒茶素具有很高的協(xié)同抑制效果，通過ELISA實驗方法測定的四種藥物的

6、混合物對整合酶的半數(shù)抑制濃度（IC50=0.1μmol/L）優(yōu)于已用于臨床的整合酶抑制劑raltegravir。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)四種含沒食子酰基(CG、EGCG、GCG，ECG)的兒茶素對HIV-1整合酶有顯著的抑制效果,其作用機制為兒茶素結(jié)合在Tyr143和Gln148氨基酸上，改變整合酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Gly140-Gly149）的柔韌性，從而降低整合酶的活性。四種兒茶素具有很高的協(xié)同抑制效果，其混合物對整合酶的半數(shù)抑制濃度為（IC

7、50=0.1μmol/L），表明含沒食子?；膬翰杷赜型蔀橐环N新的HIV-1整合酶抑制劑。
　　第二部分：
　　目的：分化抑制蛋白（Id）家族在細胞增殖、分化、以及腫瘤發(fā)生進展過程中均有重要作用。對該家族蛋白的N端序列進行保守性結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建其基因突變體。
　　方法：應(yīng)用ClustalX(1.81)軟件對Id蛋白家族中三個成員（Id1-3）的N端序列進行同源性分析；Swiss-PdbViewer3.7(SP5)軟件模

8、擬高同源區(qū)域中關(guān)鍵性氨基酸突變前后的三維結(jié)構(gòu)模型；先用PCR方法將突變點引入Id序列，再通過重疊PCR方法擴增出全長編碼序列；酶切與測序確證突變序列的準確性。
　　結(jié)果：Id1-3蛋白的N端存在一個由11個氨基酸形成的高度保守的旋轉(zhuǎn)-螺旋（Loop-Helix）結(jié)構(gòu)，將其中最保守的絲氨酸與亮氨酸分別突變?yōu)楦拾彼崤c纈氨酸；將突變后的Id基因序列重組到pGEX原核表達載體中。
　　結(jié)論：本研究在Id1-3蛋白N端識別了一個保守的

9、Loop-Helix結(jié)構(gòu)，為深入研究其協(xié)同的功能特征提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)；突變其中的絲氨酸為研究Id蛋白潛在的磷酸化修飾及相應(yīng)功能特征的改變奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分：
　　目的：兒茶素家族化合物作為一種毒副作用小，價格低廉的天然化合物已經(jīng)體現(xiàn)出了對艾滋病毒的抑制效果，但其抑制機理仍不明確。為此研究了兒茶素家族化合物對于HIV-1整合酶的抑制效果，闡述了該家族化合物對艾滋病毒的抑制機理。
　　方法：我們采用了ELISA實驗方

10、法檢測四種帶有沒食子酰基的兒茶素對于HIV-1整合酶的抑制力。并且我們還將這四種兒茶素按照等比例混合，檢測它們協(xié)同抑制的效果。此外，我們選擇了一種最主要的不帶沒食子酰基的兒茶素EC，作為對照。我們還采用了分子對接的計算機模擬方法研究了帶有和不帶有沒食子?；膬翰杷貙τ贖IV-1整合酶的抑制機理。
　　結(jié)果：通過ELISA實驗方法，發(fā)現(xiàn)四種含有沒食子?；膬翰杷?，包括Catechingallate(CG)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（

11、Epigallocatechingallate，EGCG），Gallocatechingallate(GCG)，和表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechingallate,ECG）對HIV-1整合酶有顯著的抑制效果。通過分子對接的研究發(fā)現(xiàn)，當HIV-1整合酶沒有結(jié)合病毒DNA的時候，這四種兒茶素會結(jié)合在Tyr143和Gln148氨基酸上，因此改變了整合酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Gly140-Gly149）的柔韌性，從而降低了整合酶的活性。此外，當整合

12、酶與病毒DNA結(jié)合上之后，這四種兒茶素可以結(jié)合在整合酶與病毒DNA之間，從而干擾其整合效率。并且，這四種兒茶素具有很高的協(xié)同抑制效果，通過ELISA實驗方法測定的四種藥物的混合物對整合酶的半數(shù)抑制濃度（IC50=0.1μmol/L）優(yōu)于已用于臨床的整合酶抑制劑raltegravir。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)四種含有沒食子?；膬翰杷兀–G、EGCG、GCG，ECG對HIV-1整合酶有顯著的抑制效果。其作用機制為四種兒茶素結(jié)合在Tyr1