分化抑制因子ID1在調(diào)控化療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞“干性”改變中的作用研究.pdf

1、背景:
　　原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular cell carcinoma，HCC，簡(jiǎn)稱“肝癌”）是最常見的原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率占惡性腫瘤的第5位，死亡率居第3位。早期肝癌治療的主要手段是手術(shù)切除、肝移植和局部消融治療，可使患者獲得超過(guò)50％的5年生存率，但僅不足30％的患者有機(jī)會(huì)接受根治性治療，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期、或在根治術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，需要接受肝動(dòng)脈栓塞化療(TACE)、索拉非尼或全

2、身化療等姑息治療方法。但無(wú)論是接受局部的肝動(dòng)脈栓塞化療還是系統(tǒng)性的化療，多數(shù)患者仍將面臨因肝癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移或繼發(fā)耐藥而導(dǎo)致的治療失敗。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSCs)是近年來(lái)腫瘤學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，CSCs是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，它們具有自我更新能力，形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞。由于對(duì)常規(guī)化療藥物和現(xiàn)有的靶向治療耐藥，造成腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥。雖然對(duì)CSCs重要性的認(rèn)識(shí)不斷加深

3、，但是對(duì)于其細(xì)胞起源仍存在爭(zhēng)議，究竟是源于正常干細(xì)胞發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化還是已分化的腫瘤細(xì)胞獲得的自我更新能力目前還不清楚。有研究顯示，化療藥物治療后可導(dǎo)致未能清除的殘留肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性惡化，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）和“干性”（stemness）增強(qiáng)。
　　ID1作為一個(gè)癌基因，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。ID1高表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞獲得類似于干細(xì)胞的

4、特性，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥。本課題組的前期研究中，運(yùn)用全基因組芯片篩選并驗(yàn)證奧沙利鉑治療組和對(duì)照組肝癌皮下瘤差異基因，發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑治療組裸鼠肝癌皮下瘤組織ID1表達(dá)明顯上調(diào)，提示ID1在奧沙利鉑治療后干性轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。
　　目的:
　　通過(guò)研究ID1在化療誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生“干性”改變中的作用，了解ID1調(diào)控干性改變的可能分子機(jī)制，為干預(yù)肝癌耐藥、探索針對(duì)肝癌干細(xì)胞的靶向治療打下理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　

5、首先建立奧沙利鉑耐藥的肝癌細(xì)胞株。選用高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H，以梯度濃度2、5、25μmol/L奧沙利鉑序貫培養(yǎng)，使細(xì)胞逐步耐受奧沙利鉑并穩(wěn)定生長(zhǎng)，最終獲取細(xì)胞株并命名為MHCC97H-OXA。CCK8方法檢測(cè)其對(duì)奧沙利鉑的敏感性，通過(guò)檢測(cè)CSC相關(guān)分子標(biāo)志以及轉(zhuǎn)移、“干性”功能驗(yàn)證肝癌耐藥細(xì)胞株的“干性”特征。進(jìn)一步構(gòu)建干擾（ID1-KD）和過(guò)表達(dá)ID1（ID1-OE）的不MHCC-97H細(xì)胞穩(wěn)定株，確定ID1調(diào)控肝

6、癌細(xì)胞“干性”的機(jī)制。最后用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)152例手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌患者的組織芯片進(jìn)行分析，Kaplan-Meier方法計(jì)算總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期，Log-rank方法比較高表達(dá)組和低表達(dá)組兩組間的差異。
　　結(jié)果:
　　1.運(yùn)用CCK8方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和其相應(yīng)的耐藥細(xì)胞株MHCC97H-OXA對(duì)奧沙利鉑的藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)，驗(yàn)證了耐藥株的耐藥性(P＜0.0001);但其增殖速度明顯低于

7、野生型株(P＜0.0001)。WB比較MHCC-97H和MHCC97H-OXA細(xì)胞中Aurora-A和ID1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MHCC97H-OXA中Aurora-A和ID1表達(dá)均較野生株升高。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)分析耐藥細(xì)胞株的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHCC97H-OXA細(xì)胞株的遷移明顯增強(qiáng)(P＜0.0001)。進(jìn)而通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)分析耐藥細(xì)胞株的侵襲能力，發(fā)現(xiàn)MHCC97H-OXA細(xì)胞株的侵襲能力顯著增強(qiáng)(P＜0.0001)。為進(jìn)一步分析奧

8、沙利鉑耐藥株的成瘤能力，我們做了平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)盡管耐藥株的增殖變慢，但是其克隆形成能力明顯增強(qiáng)(P=0.0002)。
　　2.通過(guò)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建ID1干擾或過(guò)表達(dá)的MHCC-97H細(xì)胞株，分別命名為ID1-KD和ID1-OE，觀察敲低或過(guò)表達(dá)ID1對(duì)肝癌細(xì)胞干性的影響。與對(duì)照組相比，ID1敲低后細(xì)胞的遷移能力顯著下降(P=0.002);侵襲能力下降(P=0.01);克隆形成能力也顯著下降(P＜0.0001)，對(duì)奧沙

9、利鉑的敏感性顯著增強(qiáng)(P＜0.0001)。反之，與對(duì)照組相比，ID1過(guò)表達(dá)的MHCC-97H細(xì)胞株(ID1-OE)中，克隆形成能力顯著增強(qiáng)(P=0.0003)，對(duì)奧沙利鉑的敏感性顯著下降(P＜0.0001);ID1敲出后，伴有Aurora-A激酶表達(dá)下降，而ID1過(guò)表達(dá)后，Aurora-A激酶的表達(dá)同時(shí)上調(diào)。
　　3.Aurora-A抑制劑VX-689可遏制ID1誘導(dǎo)的克隆形成能力(P＜0.0001)，顯著增加其對(duì)奧沙利鉑的敏感性

10、(P＜0.0001)。而且VX-689500nM作用于MHCC97H-OXA細(xì)胞后，可降低Aurora-A激酶活性，表現(xiàn)為p-Aurora A(Thr288)的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)耐藥細(xì)胞的遷移能力(P＜0.0001)、侵襲能力(P＜0.0001)、克隆形成能力均明顯受抑(P＜0.0001)，VX-689也逆轉(zhuǎn)了MHCC97H-OXA細(xì)胞的耐藥性(P＜0.0001)。
　　4.對(duì)152例HCC患者的組織進(jìn)行免疫組化分析，中位隨訪時(shí)間為5

11、1.17±21.46個(gè)月。Aurora-A高表達(dá)患者58例，低表達(dá)94例。低表達(dá)組的中位OS尚未達(dá)到，高表達(dá)組的中位OS為30個(gè)月，P＜0.001;低表達(dá)組的中位RFS尚未達(dá)到，而高表達(dá)組的中位RFS為15個(gè)月，兩組間比較P值＜0.001。ID1高表達(dá)組患者68例，低表達(dá)患者84例，低表達(dá)組的中位OS尚未達(dá)到，高表達(dá)組的中位OS為35個(gè)月，P＜0.001; ID1低表達(dá)組的中位RFS也未達(dá)到，而高表達(dá)組的中位RFS為23個(gè)月，P=0.0

12、013。用Pearson Correlation分析顯示，Aurora-A與ID1兩者相關(guān)系數(shù)=0.285，P＜0.001。多因素分析顯示，Aurora-A和ID1分別是與肝癌患者OS相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素，Aurora-A也是與RFS有關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素。Aurora-A和ID1同時(shí)高表達(dá)組的患者預(yù)后最差，中位OS和RFS較僅Aurora-A或ID1為高表達(dá)或同時(shí)為低表達(dá)/陰性組的中位OS和RFS均明顯縮短，P＜0.001。
　　結(jié)論

13、:
　　1.體外細(xì)胞水平研究顯示，耐藥的MHCC97H-OXA細(xì)胞株Aurora-A表達(dá)升高并伴有干性相關(guān)因子和功能的增強(qiáng)。
　　2.分化抑制因子ID1是調(diào)控肝癌細(xì)胞發(fā)生干性表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，干擾ID1表達(dá)可以抑制其干性和耐藥。
　　3.ID1可通過(guò)Aurora-A的介導(dǎo)促進(jìn)HCC細(xì)胞發(fā)生干性轉(zhuǎn)化。抑制Aurora-A活性可以逆轉(zhuǎn)ID1誘導(dǎo)的干性及耐藥。
　　4.Aurora-A及ID1是與肝癌患者OS有關(guān)的獨(dú)

14、立預(yù)后因素，Aurora-A也是與RFS有關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素，兩者表達(dá)密切相關(guān)。Aurora-A和ID1同時(shí)過(guò)表達(dá)的患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總生存期最短，預(yù)后最差，從臨床上驗(yàn)證了Aurora-A和ID1間的互相促進(jìn)關(guān)系，兩者同時(shí)過(guò)表達(dá)的患者更容易復(fù)發(fā)和進(jìn)展。
　　應(yīng)用價(jià)值:
　　1.明確了化療后肝癌細(xì)胞的耐藥性與殘余腫瘤細(xì)胞的”干性”增強(qiáng)有關(guān)，有助于開發(fā)靶向作用于腫瘤干細(xì)胞的藥物以克服傳統(tǒng)化療無(wú)法根除腫瘤細(xì)胞的不足，降低HCC的轉(zhuǎn)移

15、和復(fù)發(fā)。
　　2.ID1是調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生“干性”轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，阻斷ID1有助于逆轉(zhuǎn)HCC的“干性”。ID1是值得進(jìn)一步探索治療靶點(diǎn)。
　　3.Aurora-A可介導(dǎo)ID1調(diào)控HCC的“干性”轉(zhuǎn)化，抑制Aurora-A激酶可干擾ID11誘導(dǎo)的“干性”改變和耐藥;而阻斷Aurora-A激酶活性可以克服化療后誘導(dǎo)的“干性”。本實(shí)驗(yàn)為Aurora-A抑制劑用于HCC的臨床試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。
　　4.Aurora-A和ID