耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌臨床株耐藥機制的研究.pdf

1、目的： 由耐碳青霉烯多重耐藥不動桿菌引起的嚴重院內(nèi)感染近年呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，使臨床醫(yī)生面臨巨大的挑戰(zhàn)，對其耐藥機制的研究成為了一個重要的課題。本試驗采用分子生物學方法研究鮑曼不動桿菌臨床株對亞胺培南和美洛培南耐藥機制包括細菌產(chǎn)OXA型碳青霉烯酶和外膜孔通道蛋白的缺失，為指導醫(yī)生合理使用抗菌藥物，以克服或減少細菌耐藥性的出現(xiàn)或傳播，以及新型抗菌藥物的研制提供依據(jù)。 方法： 1、菌株：從收集的天津市2001年～20

2、05年鮑曼不動桿菌20株臨床株中篩選出對碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南和美洛培南)耐藥的菌株。 2、藥敏試驗：采用瓊脂紙片擴散法(K-B法)和微量肉湯稀釋法測定臨床菌株對13種常用抗菌藥物的敏感性。 3、PCR擴增碳青霉烯酶bla<,OXA-23-like>基因：根據(jù)GenBank公布的序列，設計一對bla<,OXA-23>和bIa<,OXA-27>基因的通用引物。上游引物SQ1 5'-GATGTGTCATAGTATTCG

3、TCG-3'，定位于編碼基因開放可讀框的-108～-88位堿基；下游引物SQ2 5'-TCACAACAACTAAAAGCACTG-3'，定位于編碼基因開放可讀框的+930～+950位堿基，進行聚合酶鏈式反應(PCR)，產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。 4、外膜蛋白提取及進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。 5、PCR擴增外膜蛋白carO基因：根據(jù)GenBank公布的序列，設計carO基因的特異性引物。上游引

4、物OMP1 5'-ATGAAAGTATTACGTGTTTTAGTG-3'，定位于carO基因+1～+24位堿基；下游引物OMP2 5'-TTACCAgTAgAAgTTTACACC-3'，定位于carO基因+724～+744位堿基，進行PCR擴增，產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。 6、 PCR產(chǎn)物序列分析。 結果： 1、藥敏試驗：從20株鮑曼不動桿菌的臨床株中篩選出3株對亞胺培南和美洛培南耐藥的臨床株AB13、A

5、B24和AB173，對13種臨床常用的抗菌藥物的藥敏結果顯示：AB13、AB24和AB173除對氧氟沙星、左氧氟沙星呈敏感外，對環(huán)丙沙星低度耐藥，并且?guī)缀鯇λ袦y試的β-內(nèi)酰胺類(哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢氨噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦)、氨基糖甙類(阿米卡星、慶大霉素)和四環(huán)素高度耐藥，為多重耐藥株。 2、bla<,OXA-23-like>婦基因PCR-DNA序列分析：使用引物SQl和SQ2，3株耐藥臨床

6、株AB13、AB24、AB173 PCR擴增產(chǎn)物均出現(xiàn)一條1058bp大小的陽性條帶，1株敏感株AB942和對照菌株大腸埃希菌ATCC25922、嗜麥芽窄食單胞菌Sme006 PCR擴增均呈陰性。3條PCR產(chǎn)物全部進行測序分析，結果顯示AB13、AB24和AB173編碼序列完全一致，與GenBank中的bla<,OXA-23>基因序列對比未出現(xiàn)變異，一致性100％。 3、外膜蛋白電泳： SDS-PAGE分析顯示與敏感株AB942

7、電泳條帶相比較，耐碳青霉烯臨床株AB173的外膜蛋白電泳條帶在29KDa處出現(xiàn)明顯缺失，其余2株耐碳青霉烯臨床株AB13、AB24無明顯條帶差異。 4、CARO基因PCR-DNA序列分析：使用引物OMP1和OMP2，對carO基因進行PCR擴增，結果顯示碳青霉烯敏感的臨床株AB942、碳青霉烯耐藥的臨床株AB13和AB24(SDS-PAGE凝膠電泳條帶無變化)、碳青霉烯耐藥的臨床株AB173(SDS-PAGE凝膠電泳29KDa條

8、帶處缺失)在744bp處均出現(xiàn)了陽性擴增條帶。將AB942、AB13、AB173的PCR產(chǎn)物進行序列分析，與GenBank中的carO基因序列(AY684798)比較相似性分別是81％、80％、77％。根據(jù)編碼區(qū)堿基序列推導的氨基酸序列與GenBank中的CarO蛋白氨基酸序列(AAV80243)相似性分別是76％、72％、74％。 結論： 3株多重耐藥鮑曼不動桿菌臨床株都攜帶bla<,OCS-23>基因，其中一株還伴有