利用神經(jīng)細胞損傷模型研究新型雌激素受體ER-α36在雌激素神經(jīng)保護中的作用及相關機制.pdf

1、雌激素是對一組甾體類激素的總稱，人體內(nèi)的雌激素主要包括雌酮(estrone，E1)、17α-雌二醇(17α-estradiol，E2α)、17β-雌二醇(17β-estradiol，E2β)，雌三醇(estriol，E3)等。雌激素是重要的女性激素，其主要生理作用包括促進女性性器官的發(fā)育成熟，維持女性第二性征，調(diào)節(jié)女性生殖周期等。隨著生命科學的發(fā)展，人們對雌激素的認識也逐漸深入。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的生物學作用廣泛，參與人體多個系統(tǒng)功能，包

2、括調(diào)節(jié)骨骼及脂類代謝，維持心血管穩(wěn)態(tài)等。在神經(jīng)系統(tǒng)中，雌激素同樣發(fā)揮著重要的作用，包括促進神經(jīng)元細胞生長、分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌，維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)以及神經(jīng)保護作用等。本研究主要關注雌激素的神經(jīng)保護作用。
　　雌激素通過與雌激素受體(Estrogen receptor, ER)結合而發(fā)揮效應。經(jīng)典的雌激素受體包括雌激素受體ER-α（主要指ER-α66）及ER-β。ER-α及ER-β均定位于細胞核，是核雌激素受體。ER-α36是200

3、5年Dr.Wang研究小組發(fā)現(xiàn)并克隆的新型雌激素受體，主要定位于細胞膜，是ER-α的一個全新亞型。作為一種新型的雌激素受體，ER-α36已被證實在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用至今尚未見報道。
　　雖然多項研究已經(jīng)證實雌激素具有神經(jīng)保護作用，但相關作用機制尚未完全明了，對介導雌激素神經(jīng)保護作用的關鍵受體也一直存在爭議。本課題采用過氧化氫(H2O2)處理人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y及IMR-32建立神經(jīng)

4、細胞損傷模型，同時采用17β-雌二醇及ER-α36特異性激動劑(G1)處理細胞，明確雌激素在神經(jīng)保護作用中的關鍵受體，研究雌激素神經(jīng)保護作用的分子機制，為神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)細胞損傷的治療提供新思路及新的藥物作用靶點。
　　研究背景:
　　多項針對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究證實，雌激素具有明確的神經(jīng)保護作用。臨床調(diào)查顯示，接受雌激素替代治療的婦女患帕金森病(Parkinson's disease，PD)的風險顯著下降;另有報道雌激素

5、替代治療可以降低絕經(jīng)期女性阿爾茨海默(Alzheimer's disease，AD)的患病率;雌激素還能有效緩解腦損傷或腦缺血中風造成的神經(jīng)元死亡現(xiàn)象。神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變往往伴隨有神經(jīng)炎癥的發(fā)生，有研究發(fā)現(xiàn)雌激素具有對抗神經(jīng)炎性損傷的作用。隨著體內(nèi)雌激素水平的下降，絕經(jīng)期婦女更易發(fā)生包括神經(jīng)炎癥在內(nèi)的多系統(tǒng)炎癥，而適當劑量的雌激素治療則可以顯著緩解此類炎癥反應。雌激素的神經(jīng)保護及抗神經(jīng)炎癥作用，是現(xiàn)代神經(jīng)生物學的重要研究方向之一，對于全

6、面揭示雌激素的生物學功能，研發(fā)有效的、靶向性神經(jīng)退行性疾病治療藥物具有重要意義。
　　雌激素與雌激素受體結合發(fā)揮生物學作用，主要涉及兩種不同的分子機制:1）基因組作用模式，即雌激素進入細胞與受體結合后，轉(zhuǎn)移入核，對靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;2）非基因組作用模式，即雌激素通過與細胞膜上的雌激素受體結合，誘導一系列激酶活性，激活細胞內(nèi)信號通路而發(fā)揮作用。經(jīng)典的雌激素受體包括雌激素受體-α（Estrogen receptor-α，ER-α

7、，包括ER-α66和ER-α46兩種亞型）和雌激素受體-β（Estrogen receptor-β，ER-β），這兩類受體都是核受體家族成員，主要參與雌激素的基因組作用模式。雖然已經(jīng)明確非基因組作用模式在雌激素神經(jīng)保護中發(fā)揮重要作用，但是受經(jīng)典雌激素受體理論的限制，人們對非基因組作用模式在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及相關機制研究仍然不夠深入。
　　研究目的:
　　采用H2O2分別處理SH-SY5Y和IMR-32細胞建立神經(jīng)細胞損傷模型

8、，觀察E2β及ER-α36特異性激動劑G1對損傷細胞的保護作用，初步明確ER-α36是否參與了雌激素神經(jīng)保護作用;在此基礎上通過干擾細胞內(nèi)ER-α36表達及建立ER-α36高表達細胞株進一步研究ER-α36在雌激素神經(jīng)保護中的作用，并研究其相關分子機制。
　　研究方法:
　　采用250μMH2O2分別處理SH-SY5Y及IMR-32細胞建立神經(jīng)細胞損傷模型，然后用10nM的E2β及G1處理細胞， MTT法和流式細胞術分別對細

9、胞的存活率和凋亡情況進行檢測，建立研究雌激素神經(jīng)保護作用的細胞模型，初步明確ER-α36是否參與雌激素神經(jīng)保護作用。采用Western blotting檢測E2β及G1處理細胞后不同時間點PI3K/AKT和MAPK/ERK通路的激活情況，明確與E2β神經(jīng)保護作用相關的非基因組快速反應通路。在此基礎上建立ER-α36干擾細胞株及高表達細胞株，Westernblotting觀察E2β及G1處理后，雌激素快速反應通路激活情況的變化，明確ER-

10、α36是通過介導雌激素的非基因組信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　研究結果:
　　(1) MTT檢測結果表明E2β及G1能顯著減少H2O2損傷引起的細胞存活力下降，發(fā)揮細胞保護作用;在ER-α36干擾細胞株，E2β及G1的保護作用被顯著抑制，而在ER-α66干擾細胞株中E2β及G1的保護作用不受影響。
　　(2)流式細胞計數(shù)結果表明E2β及G1能顯著減少H2O2損傷引起的細胞凋亡;在ER-α36干擾細胞株中E2β及G1不

11、能減少H2O2損傷引起的細胞凋亡，而在ER-α66干擾細胞株中E2β及G1的這一作用基本不受影響。
　　(3) Western blotting結果表明E2β及G1能在5分鐘內(nèi)快速激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路，而在ER-α36干擾細胞株中E2β及G1的這一作用被顯著抑制;在ER-α66干擾細胞株中E2β及G1的這一作用基本不受影響。該結果表明ER-α36參與介導了雌激素的非基因組快速效應。
　　(4)建立E

12、R-α36高表達細胞株，干擾該細胞株中GPR30表達，Western blotting結果發(fā)現(xiàn)E2β及G1仍能迅速激活該種細胞MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路。這一結果表明GPR30沒有參與ER-α36介導的雌激素快速反應通路的激活過程。
　　結論:
　　ER-α36參與了雌激素的神經(jīng)保護作用，并介導了雌激素的非基因組快速反應，包括激活MAPK/ERK和PI3K/AKT等快速信號通路;GPR30沒有參與ER-α36