與sFlt-1相關(guān)的miR-10b和miR-200c在子癇前期發(fā)病中作用的研究.pdf

1、子癇前期(pre-eclampsia,PE)是一種嚴(yán)重的妊娠特有疾病,發(fā)病率約為10％,是妊娠期導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。較早的研究發(fā)現(xiàn)PE患者外周血可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子1(soluble fms-like tyrsine kinase-1,sFlt-1)表達(dá)異常增高,在子癇前期的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著重要的作用。目前關(guān)于sFlt-1導(dǎo)致子癇前期發(fā)病的機(jī)理,普遍認(rèn)為在PE患者發(fā)病起始,由于某種原因?qū)е禄颊咛ケP(pán)sFlt-1表達(dá)異常

2、增高,致使患者胎盤(pán)血管重鑄障礙及全身毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷。但是,導(dǎo)致sFlt-1表達(dá)異常增高的具體機(jī)制尚不清楚。
　　微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼小分子RNA,多項(xiàng)研究已經(jīng)證明其在基因調(diào)控方面起著重要的作用。近來(lái)的研究表明,某些miRNA在小鼠和人胎盤(pán)組織中表達(dá)異常升高,在PE患者胎盤(pán)中差異表達(dá)。越來(lái)越多的研究證實(shí)在PE患者胎盤(pán)中部分差異表達(dá)的miRNA在細(xì)胞粘附、免疫、信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞周期、心血管

3、的發(fā)育等等,這些在子癇前期發(fā)病中起著主要作用的通路上發(fā)揮著重要的作用。由此可見(jiàn),miRNA與子癇前期的關(guān)系是一個(gè)全新的研究熱點(diǎn)。
　　在前期的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤(pán)中miR-10b及miR-200c存在差異表達(dá),生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其異常表達(dá)可能與sFlt-1異常增高相關(guān)。因此有必要從miRNAs角度深入研究導(dǎo)致sFlt-1異常表達(dá)的具體機(jī)理,及其對(duì)sFlt-1生物學(xué)功能的影響,從而為研究子癇前期發(fā)病機(jī)理提供新的線索。

4、　　目的
　　1.檢驗(yàn)miR-10b和miR-200c是否在PE胎盤(pán)組織中與正常胎盤(pán)存在差異表達(dá),驗(yàn)證其與sFlt-1是否具有相關(guān)性。
　　2.闡明miR-10b和miR-200c與sFlt-1的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　3.研究 miR-10b對(duì)正常人滋養(yǎng)細(xì)胞系(HTR-8/SVneo))生物學(xué)功能的調(diào)控,進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)理。
　　方法
　　1. ELISA檢測(cè)不同孕周孕婦外周血血清sFlt-1的表達(dá)以及孕晚

5、期PE患者與正常孕婦外周血 sFlt-1的差異表達(dá);step-loop實(shí)時(shí)定量 PCR(Real-time PCR)的方法驗(yàn)證PE組與正常孕婦組中miR-10b及miR-200c的表達(dá);驗(yàn)證miR-10b及miR-200c表達(dá)與sFlt-1差異及患者病情輕重是否存在相關(guān)性。
　　2.構(gòu)建 sFlt-1表達(dá)質(zhì)粒,熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證 miR-10b及 miR-200c與sFlt-1的靶向作用關(guān)系;過(guò)表達(dá)miR-10b后, Rea

6、l time PCR技術(shù)檢測(cè)在人正常滋養(yǎng)細(xì)胞系(HTR-8/SVneo)中miR-10b及sFlt-1 mRNA的表達(dá);同時(shí)ELISA檢測(cè)sFlt-1的蛋白表達(dá)。
　　3.在人正常滋養(yǎng)細(xì)胞系(HTR-8/SVneo)抑制miR-10b,采用MTT、流式雙染細(xì)胞術(shù)、侵襲小室技術(shù)、三維細(xì)胞成型實(shí)驗(yàn),檢測(cè)抑制 miR-10b對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、增殖周期、浸潤(rùn)以及血管內(nèi)皮成型功能等功能的影響。
　　結(jié)果
　　1. ELISA結(jié)果

7、顯示,在不同孕周孕婦外周血血清中sFlt-逐漸升高,s-PE患者外周血中sFlt-1明顯高于正常妊娠組(5795.7±629.11VS2144.2±406.16)(P<0.05)。step-loop實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)結(jié)果顯示,PE患者胎盤(pán)組織中miR-10b的表達(dá)較正常孕婦組明顯降低(0.43±0.21 VS1.08±0.32)(P<0.05),而 PE患者中miR-200c的表達(dá)較正常孕婦組升高(5.26±0

8、.35VS1.07±0.03)(P<0.05)。miR-10b及200c差異表達(dá)與sFlt-1具有一定的相關(guān)性。
　　2.采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證,構(gòu)建含有 sFlt-1全長(zhǎng)3’UTR的GV126-sFlt-1-3’UTR報(bào)告基因質(zhì)粒,分別含有針對(duì)結(jié)合種子區(qū)突變4個(gè)堿基的突變體GV126-sFlt-1-3’UTR-mut1(10b)和GV126-sFlt-1-3’UTR-mut2(200c)。結(jié)果證實(shí),轉(zhuǎn)染miR-10

9、b mimcs與野生型載體的實(shí)驗(yàn)組后熒光素酶活性下降40%,而突變體無(wú)明顯改變;轉(zhuǎn)染miR-200c mimcs與野生型載體的實(shí)驗(yàn)組起熒光素酶活性無(wú)明顯改變。此外,在人正常滋養(yǎng)細(xì)胞系(HTR-8/SVneo)中抑制miR-10b,ELISA結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)液中sFlt-1增加42%。
　　3. MTT及流式雙染細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在人正常滋養(yǎng)細(xì)胞系(HTR-8/SVneo)抑制miR-10b表達(dá),各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖

10、及凋亡無(wú)明顯差異(P>0.05);但是侵襲實(shí)驗(yàn)顯示;miR-10b對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)有明顯的促進(jìn)作用,兩者間存在明顯差異(41.25±7.8VS65.8±11.6)(P<0.05)。抑制表達(dá)miR-10b后滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液sFlt-1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有明顯差異(310.5±20.4VS182.3±38.5)(p<0.05),對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞成型功能有抑制作用(2.43±0.28 VS6.32±0.32)(p<0.05)。
　　結(jié)論