miR-200c和miR-141在胃癌中表達(dá)、功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、本研究采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-timereverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測miR-200家族五個成員在胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中的表達(dá)，同時檢測胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27和胃上皮細(xì)胞株GES-1中miR-200c和miR-141的表達(dá)，深入分析miR-200c和miR

2、-141的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征、無病生存期(disease-free survival，DFS)及腫瘤標(biāo)記物CA50、CEA、CA199和CA724的關(guān)系。單獨(dú)或同時進(jìn)行miR-200c和miR-141的過表達(dá)或沉默，并通過CCK-8(Cell-Counting Kit-8 assay)實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究miR-200c和miR-141對胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，利用雙熒光素

3、酶報(bào)告基因分析檢測miR-200c和miR-141對其預(yù)測靶基因E盒結(jié)合鋅指蛋白-1、-2(zincfinger E-box-binding homeobox1/2，ZEB1/2)的靶向作用，采用qRT-PCR和Western-blot檢測胃癌細(xì)胞株SGC-7901中miR-200c和miR-141對其預(yù)測靶基因ZEB1/2及ZEB1/2的抑制基因E-cadherin的影響。同時檢測胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中miR-200c和miR

4、-141預(yù)測靶基因ZEB1和ZEB2的表達(dá)情況，分析其與miR-200c和miR-141表達(dá)水平的關(guān)系。利用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換-甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Bisulfite conversion-specific andmethylation-specific polymerase chain reaction，MSP)和qRT-PCR技術(shù)檢測胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中miR-200c/141簇上游CpG島的甲基化水平及TGF-β的表達(dá)

5、情況，分析其與miR-200c和miR-141表達(dá)水平的關(guān)系。采用qRT-PCR技術(shù)檢測TGF-β和去甲基化抗腫瘤藥物地西他濱（5-aza-2'-deoxycytidine，5-AdC）對miR-200c和miR-141在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中表達(dá)的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下分為以下幾部分展開論述:
　　第一部分 miR-200家族在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及其與臨床病理特征和DFS的關(guān)系
　　目的:通過檢測miR-

6、200家族在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達(dá)，以及在四種胃癌細(xì)胞系和一種正常胃上皮細(xì)胞系中的表達(dá)，探討其在胃癌中的表達(dá)情況及其與胃癌患者臨床病理特征及DFS的關(guān)系。
　　方法:采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-200家族在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達(dá)，檢測miR-200c和miR-141在四種胃癌細(xì)胞系和一種正常胃上皮細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA-200家族在胃癌組織和配對的癌旁非癌組織

7、中的表達(dá)水平。
　　2.miR-200c和miR-141在胃癌細(xì)胞系及正常胃上皮細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　3.胃癌組織中miR-200c和miR-141的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。
　　4.miR-200c和miR-141的表達(dá)水平與患者DFS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P=0.002和P=0.012)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-200c和miR-141在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于配對癌旁非癌組織，而其他mi

8、R-200家族成員沒有顯著變化中。與正常胃上皮細(xì)胞GES-1相比，miR-200c和miR-141的表達(dá)在4株胃癌細(xì)胞株也顯著降低。提示miR-200c和miR-141可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。
　　2.胃癌組織中miR-200c和miR-141表達(dá)與腫瘤侵潤深度與脈管瘤栓情況存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-200c和miR-141可能在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。
　　3.miR-200c和miR-14

9、1可能成為胃癌預(yù)后的潛在提示指標(biāo)。
　　第二部分 miR-200c和miR-141對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究
　　目的:探討miR-200c和miR-141在胃癌中的功能及其發(fā)揮功能的機(jī)制。
　　方法:單獨(dú)或共同轉(zhuǎn)染miR-200c和miR-141模擬物或是抑制物或是陰性對照，通過CCK-8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察miR-200c和miR-141在胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用

10、。運(yùn)用MicroRNA生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件，對其可能的作用靶序列進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)合miR-200c和miR-141在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能，進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析的方法檢測對其預(yù)測靶基因靶向作用，采用qRT-PCR和Western-blot檢測胃癌細(xì)胞株SGC-7901中miR-200c/141簇對其預(yù)測靶基因的影響。同時檢測胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中miR-200c/141預(yù)測靶基因的表達(dá)情況，分析其與mi

11、R-200c和miR-141表達(dá)水平的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.miR-200c或（和）miR-141對胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響。
　　2.miR-200c或（和）miR-141對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證ZEB1和ZEB2為miR-200c/-141的共同靶基因。
　　4.在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中過表達(dá)miR-200c/14

12、1對ZEB1/2和E-cadherin表達(dá)的影響。
　　5.ZEB1和ZEB2在胃癌組織中的表達(dá)顯著升高(P=0.001;P=0.004)。ZEB1的表達(dá)水平與miR-200c表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)（P=0.029），ZEB2的表達(dá)水平與miR-200c和miR-141的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)（P=0.001，＜0.001）。
　　結(jié)論:
　　1.miR-200c/141可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　2.在胃癌細(xì)胞

13、株SGC-7901中，miR-200c/141通過靶向抑制ZEB1和ZEB2的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)E-cadherin的表達(dá)升高來發(fā)揮其抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　3.在胃癌患者中miR-200c/141可能是通過ZEB1和（或）ZEB2途徑調(diào)控胃癌的發(fā)展。
　　第三部分 TGF-β和miR-200c/141 CpG島甲基化水平對miR-200c/141表達(dá)的影響
　　目的:通過檢測胃癌組織和配對癌旁非癌組織中TGF-β的

14、表達(dá)水平和miR-200c/141 CpG島甲基化水平，探討其與miR-200c和miR-141表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　方法:采用qRT-PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上檢測TGF-β在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達(dá);運(yùn)用MSP方法檢測胃癌組織和配對癌旁非癌組織中miR-200c/141 CpG島的甲基化水平。分析TGF-β表達(dá)水平及miR-200c/141 CpG島的甲基化水平與miR-200c和miR-141水平的相關(guān)性。地西他濱和

15、（或）TGF-β處理胃癌細(xì)胞株SGC-7901，觀察其對miR-200c和miR-141表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.TGF-β在胃癌組織中的表達(dá)顯著升高(P=0.005)。TGF-β的表達(dá)水平與miR-200c和miR-141的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P=0.003,＜0.001)。
　　2.胃癌中miR-200c/141 CpG島的甲基化水平及其與miR-200c/141的相關(guān)性。
　　3.TGF-β與

16、地西他濱對SGC-7901細(xì)胞中miR-200c和miR-141表達(dá)的影響。
　　TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SGC-7901中miR-200c和miR-14i表達(dá)顯著降低（P=0.006;P=0.005）。地西他濱誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SGC-7901中miR-200c和miR-141表達(dá)顯著升高(P=0.013;P=0.027)，并能夠緩解由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的miR-200c和miR-141表達(dá)的降低(P=0.005;P=0.007)。

17、
　　結(jié)論:
　　1.胃癌中TGF-β的表達(dá)水平和miR-200c/141CpG島的甲基化水平明顯升高。
　　2.TGF-β誘導(dǎo)胃癌中miR-200c和miR-141表達(dá)降低。
　　3.胃癌中升高的miR-200c/141CpG島的甲基化水平誘導(dǎo)miR-200c和miR-141表達(dá)降低。
　　4.地西他濱能夠通過降低miR-200c/141CpG島的甲基化水平促進(jìn)miR-200c和miR-141的表達(dá)，并能