sFlt-1的表達(dá)及其信號(hào)通路與早發(fā)型子癇前期相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　子癇前期（Preeclampsia，PE）是一種嚴(yán)重影響母兒健康的產(chǎn)科重癥，是以高血壓、蛋白尿、水腫、多器官功能障礙為特征的一組疾病，發(fā)病率約為5％，病死率約為10%，是圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦及胎嬰兒死亡的重要原因。醫(yī)學(xué)界將妊娠34周前發(fā)病的子癇前期稱為早發(fā)型子癇前期（Early onset Preeclampsia，EPE），發(fā)病晚于34周者稱為晚發(fā)型子癇前期(Late onset preeclampsia，LPE)。早發(fā)型比

2、晚發(fā)型的發(fā)病早，病情重，對(duì)母兒的影響更大，各種并發(fā)癥更多，孕產(chǎn)婦預(yù)后及新生兒結(jié)局更差。因此明確早發(fā)型子癇前期的發(fā)病原因、機(jī)制、病理過(guò)程，病情的發(fā)展規(guī)律，找到有效的預(yù)防、治療方法就顯得尤為重要，并已成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。對(duì)于早發(fā)型子癇前期的治療，目前仍多以對(duì)癥治療為主。發(fā)現(xiàn)有效的分子靶點(diǎn)治療是早發(fā)型子癇前期目前亟待解決的臨床問(wèn)題。
　　胎盤生長(zhǎng)因子（PLGF）是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）家族成員之一，其與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體

3、1（Flt-1）結(jié)合，發(fā)揮促血管生成、促絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、浸潤(rùn)的作用，而這種生物學(xué)過(guò)程可被可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（sFlt-1）所阻斷。sFlt-1與Flt-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VEGF，其中包括PLGF，在完全阻斷VEGF的作用同時(shí)也阻斷了PLGF的促血管生成活性，引起血管生成障礙，影響血管壁的完整性和通透性。sFlt-1對(duì)PLGF具有強(qiáng)有力的拮抗作用，對(duì)PLGF有調(diào)節(jié)作功能。有文獻(xiàn)報(bào)道sFlt-1在高血壓、糖尿病、多種腫瘤中的表達(dá)

4、是升高的。有學(xué)者提出將sFlt-1作為子癇前期的標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)病情。文獻(xiàn)提示 PI3K/AKT通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物調(diào)節(jié)功能。研究表明該通路與人類血管性、代謝性疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后密切相關(guān)。這些研究均提示sFlt-1與PI3K/AKT通路的關(guān)聯(lián)可能成為早發(fā)型子癇前期的分子治療靶點(diǎn)。諸多研究表明細(xì)胞組織缺氧與子癇前期的發(fā)病相關(guān)，許多實(shí)驗(yàn)就是利用缺氧模型進(jìn)行該病的機(jī)制研究?；诖?，本課題著重探討了早

5、發(fā)型子癇前期患者血清、胎盤、臍帶血中sFlt-1和PLGF的表達(dá)情況，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中sFlt-1的表達(dá)情況以及缺氧培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中sFlt-1與PI3K/AKT通路的相關(guān)性。
　　方法：
　?、攀占骶┽t(yī)院2012年9月至2014年8月收容的早發(fā)型重度子癇前期39例（ESPE組）；早發(fā)型輕度子癇前期45例（EMPE組）；同時(shí)期、同孕周正常妊娠病例42例（NP組），分別采集患者靜脈血、分娩時(shí)的臍帶血和胎盤。分別用ELI

6、SA法和時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)三組患者血清和臍帶血中sFlt-1和PLGF含量；用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胎盤中sFlt-1和PLGF的mRNA的表達(dá)；用Western-blot法檢測(cè)胎盤中sFlt-1和PLGF的蛋白表達(dá)。
　?、撇杉Ｈ焉锶四殠?biāo)本，用胰酶消化法制備培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelialcells，HUVECS）。利用免疫熒光法檢測(cè)CK18，進(jìn)行了細(xì)胞鑒定。
　

7、?、墙UVECS細(xì)胞缺氧模型，用Western-blot法檢測(cè)HIF-1α和TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，鑒定了細(xì)胞缺氧的成功誘導(dǎo)。進(jìn)行缺氧細(xì)胞MTT檢測(cè)，為后續(xù)缺氧實(shí)驗(yàn)確定缺氧作用時(shí)間。
　　⑷分別用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot法分別檢測(cè)sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在正常培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、缺氧培養(yǎng)24小時(shí)及LY294002作用1小時(shí)后再缺氧培養(yǎng)24小時(shí)條件下的表達(dá)。
　　

8、⑸用細(xì)胞流氏術(shù)測(cè)定了不同缺氧方式培養(yǎng)下的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　?、旁绨l(fā)型重度子癇前期患者血清中sFlt-1的含量均數(shù)為534.5±22.6ng/L，PLGF的含量均數(shù)為34.9±8.7ng/L；早發(fā)型輕度子癇前期患者血清中sFlt-1的含量均數(shù)為398.0±47.7ng/L，PLGF的含量均數(shù)為51.6±10.4ng/L；同時(shí)期、同孕周正常妊娠患者血清中sFlt-1的含量均數(shù)為212.0±31.

9、9ng/L，PLGF的含量均數(shù)為83.3±9.3ng/L。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05，三組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。早發(fā)型重度子癇前期臍血血清中sFlt-1的含量均數(shù)為331.2±40.4ng/L，PLGF的含量均數(shù)為29.0±6.3ng/L；早發(fā)型輕度子癇前期臍血血清中sFlt-1的含量均數(shù)為192.0±27.7ng/L，PLGF的含量均數(shù)為41.3±5.0ng/L；同時(shí)期、同孕周正常妊娠臍血血清中sFlt-

10、1的含量均數(shù)為98.6±13.9ng/L，PLGF的含量均數(shù)為68.8±8.1ng/L。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05，三組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組的胎盤中sFlt-1、PLGF在mRNA水平和蛋白水平均有差異，P<0.05。
　?、瞥晒w外原代培養(yǎng)傳代的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞特異性表達(dá)CK18，證實(shí)構(gòu)建的細(xì)胞模型可靠，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　⑶mRNA和蛋白水平上sFlt-1、PI3Kp

11、85α及 p-AKT(ser473)均在正常培養(yǎng)的HUVECS低表達(dá)；在缺氧培養(yǎng)24小時(shí)HUVECS高表達(dá)；在LY294002作用1小時(shí)后再缺氧培養(yǎng)24小時(shí)的HUVECS中發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/AKT通路的同時(shí)sFlt-1的表達(dá)也發(fā)生了下調(diào)，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流氏細(xì)胞術(shù)也證實(shí)缺氧使臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生了G0和G1期阻滯，G0和G1期細(xì)胞比例升高，S期比例降低，細(xì)胞凋亡增加，而LY294002的導(dǎo)入可減弱缺氧對(duì)細(xì)胞的這種抑制作

12、用。
　　結(jié)論：
　　sFlt-1在早發(fā)型子癇前期患者血清、臍血和胎盤中較正常妊娠對(duì)照高表達(dá)，并隨著病情的加重而表達(dá)升高；PLGF在早發(fā)型子癇前期患者血清、臍血和胎盤中較正常妊娠對(duì)照低表達(dá)，并隨著病情的加重而表達(dá)降低。說(shuō)明其可能參與早發(fā)型子癇前期的發(fā)生發(fā)展，有可能作為該病的血清及組織學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。
　　sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在HUVECs缺氧模型中均出現(xiàn)了高表達(dá)，說(shuō)明細(xì)胞組織缺氧可能與