外膜蛋白T在尿路致病性大腸桿菌致病機(jī)理中的作用的初步研究.pdf

1、一、研究背景和目的：
　　 尿路感染(Urinary tract infection,UTIs)是臨床上最普遍的細(xì)菌感染之一。女性比男性易感,約有81％的UTIs發(fā)生在女性,年齡在16到35歲之間,其中27％女性在初次尿路感染后半年內(nèi)復(fù)發(fā),48％在一年內(nèi)復(fù)發(fā)。其次,UTIs也是老年人和小兒常見的感染性疾病[1-3]。目前尿路感染以抗生素治療為主。
　　 尿路致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichi

2、a coli,UPEC)引起的UTIs占80％-90％。大部分尿路致病菌起源于腸道,并經(jīng)尿道上行至膀胱,約95％的UTIs起始感染部位是膀胱。目前對尿路感染的研究主要圍繞UPEC展開的。UPEC相關(guān)毒力因素包括:α-溶血素、細(xì)胞毒壞死因子1等毒素；含鐵產(chǎn)氣桿菌素；莢膜；脂多糖等和一些粘附器官[4-9]。其中UPEC對宿主尿路上皮細(xì)胞的粘附能力是其致病的最重要因素,粘附素的表達(dá)常常是致病的關(guān)鍵,其有助于UPEC黏附尿路從而避免被大量尿液沖

3、刷清除。流行病學(xué)分析及臨床研究表明:不同于直腸來源的大腸桿菌,UPEC幾乎都是B2型,表達(dá)典型的UTIs相關(guān)O抗原,帶有許多與尿路致病相關(guān)的毒力基因,如:編碼FimH黏附素的基因fimH,編碼P菌毛的基因pap,編碼S菌毛的基因sfaS,編碼溶血素的基因hly,編碼鼠疫菌素受體的基因fyuA以及編碼大腸桿菌外膜蛋白T的基因ompT等。這些毒力基因的功能多與粘附、侵襲、血清抗性和代謝等相關(guān),并得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)[11]。但有些基因,如ompT,

4、絕大多數(shù)UPEC都攜帶此基因,是假定的UTIs相關(guān)毒力基因,而關(guān)于ompT在尿路致病機(jī)制中的功能一直未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本課題的目的在于初步研究基因ompT在UPEC的致病機(jī)理中是否起到一定作用。
　　 本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建UPCE CFT073的ompT基因敲除株,命名為COTD,建立人膀胱上皮細(xì)胞株5637體外細(xì)胞模型,考察ompT基因的缺失對致病株黏附及侵襲能力的影響。并且通過紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)觀察ompT基因?qū)Β裥途?/p>

5、毛的表達(dá)是否有影響。同時建立UPEC易感小鼠C57BL/6的UTIs模型,考察ompT基因的缺失是否對細(xì)菌體內(nèi)侵襲能力產(chǎn)生影響；通過病理切片分析,觀察細(xì)菌體內(nèi)聚集形態(tài)的變化。為進(jìn)一步研究ompT基因敲除導(dǎo)致的致病差異是否通過OmpT酶活性起作用,需克隆表達(dá)OmpT及失去蛋白酶活性的OmpT。因此本文第三章內(nèi)容為構(gòu)建蛋白OmpT及其失去酶活的點(diǎn)突變體的表達(dá)純化及復(fù)性方法,并對兩者酶活進(jìn)行鑒定,觀察OmpT體外水解抗菌肽的能力以及對UPCE

6、的保護(hù)作用。
　　 二、研究方法：
　　 1、Red同源重組
　　 本方法是利用大腸桿菌λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)可在細(xì)菌內(nèi)高效介導(dǎo)同源重組事件的原理,將兩端帶有同源重組臂的一段外源DNA序列導(dǎo)入并替換細(xì)菌基因組上同源重組臂序列間的DNA序列,達(dá)到目標(biāo)基因敲除的目的。
　　 第一步構(gòu)建敲除子。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上獲得的ompT基因序列,選取該基因開放閱讀框上下游50 bp片段作為同源重組臂。然后根據(jù)卡那抗性基

7、因序列設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增引物,分別與同源重組臂組成敲除子引物,命名為OmpT_Kan_F2和OmpT Kan R2,以pET28a載體為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增并純化敲除子。第二步,將編碼Red重組系統(tǒng)gam、bet和exo基因的重組質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)化到CFT073,以氨芐抗性平板篩選陽性克隆,把敲除子電轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化了pKD46的CFT073中,通過L-阿拉伯糖誘導(dǎo)同源重組的發(fā)生,以卡那霉素平板篩選出發(fā)生同源重組的克隆。最后通過正向和反向篩選

8、鑒定敲除體:正向篩選,在5’和3’同源重組臂的外側(cè)設(shè)計(jì)PCR引物。比較用這對引物從卡那霉素抗性克隆和CFT073擴(kuò)增出的PCR片段的大小。從未發(fā)生正確重組的細(xì)菌克隆上,這對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為1781 bp；而從發(fā)生正確敲除的細(xì)菌克隆(敲除體)上,這對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為2066 bp,反向篩選,在ompT基因開放閱讀框序列內(nèi)部設(shè)計(jì)一對引物。從CFT073和未發(fā)生正確重組的細(xì)菌克隆上,這對引物可擴(kuò)增出預(yù)期長度的PCR片段；而從已正確敲除

9、ompT基因的敲除體上,這對引物不能擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物。將成功構(gòu)建的敲除體命名為COTD。
　　 2、CFT073與COTD生長曲線的繪制以及菌落培養(yǎng)
　　 (1)生長曲線:從新鮮涂布的平板中挑取單菌落接種到5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)過夜,次日再將菌液以1:100的比例接種到LB培養(yǎng)基,37℃,160r/min搖床培養(yǎng),間隔一定時間取樣測OD600,繪制生長曲線圖。
　　 (2)菌落培養(yǎng):將凍存菌液以1:10

10、0的比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)14 h,取菌液做系列10倍稀釋,取10-6和10-7稀釋菌液50μl涂布LB平板,靜置培養(yǎng)過夜后計(jì)菌落數(shù)。
　　 3、體外細(xì)菌黏附及侵襲實(shí)驗(yàn)
　　 體外細(xì)胞模型采用人膀胱癌上皮細(xì)胞5637,將該細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞鋪滿單層(約1×105細(xì)胞/孔),以100細(xì)菌:1細(xì)胞的比例將細(xì)菌接種到已準(zhǔn)備好的5637單層細(xì)胞,37℃,5％CO2孵育2 h。接入的細(xì)菌樣品梯度

11、稀釋涂板計(jì)數(shù)作為接種的總細(xì)菌數(shù)。黏附實(shí)驗(yàn)中,孵育2 h后,用PBS清洗5遍,去掉PBS加入0.5％Triton X-100裂解細(xì)胞,吸出每孔樣品梯度稀釋涂板計(jì)數(shù),作為黏附到細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞和細(xì)菌孵育2 h后,每孔加入終濃度為200 mg/L的慶大霉素孵育殺死細(xì)胞外細(xì)菌,PBS清洗3遍,與黏附同樣方法裂解細(xì)胞,吸出每孔樣品梯度稀釋涂板計(jì)數(shù),作為侵襲到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)。黏附實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)中每種菌株設(shè)三個復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。<

12、br>　　 黏附率=黏附到細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)/接種總菌數(shù)×100％
　　 侵襲率=侵襲到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)/接種總菌數(shù)×100％。
　　 4、紅細(xì)胞凝集和抑制試驗(yàn)
　　 由于Ⅰ型菌毛表達(dá)甘露糖敏感血凝,因此利用紅細(xì)胞凝集和抑制試驗(yàn)觀察CFT073,COTD以及COTD(pST)Ⅰ型菌毛表達(dá)情況。豚鼠心臟取血制備紅細(xì)胞,在96孔V型反應(yīng)板中先加入25μL PBS,然后在每組第一孔加入菌株,依次稀釋,混勻,最后加入制備好的紅

13、細(xì)胞25μL,混勻,37℃孵育1h后觀察結(jié)果。紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中,在各菌株依次稀釋后,加入D-甘露糖,最后加入紅細(xì)胞,觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象是否被D-甘露糖抑制。
　　 5、小鼠尿路感染模型
　　 選擇7周齡SPF級C57B/L6小鼠進(jìn)行尿路插管膀胱灌注細(xì)菌建立小鼠尿路感染模型,注菌量約為10×107CFU。為了觀察CFT073、COTD以及COTD(pST)在動物體內(nèi)侵襲能力是否有差異,在感染后6 h取膀胱組織,PBS清

14、洗后加慶大霉素(終濃度為200μg/mL)37℃孵育1h,再以PBS清洗后,勻漿、倍比稀釋,最后涂LB平板37℃培養(yǎng)過夜,計(jì)菌落數(shù)。為了觀察CFT073、COTD以及COTD(pST)導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌聚集(Intracellular bacterial community,IBC)形成情況,感染6 h后取膀胱做石蠟切片,HE染色,觀察IBCs形態(tài)。
　　 6、OmpT及其點(diǎn)突變體的原核表達(dá)
　　 以大腸桿菌基因組DNA為

15、模板,PCR擴(kuò)增ompT基因,連接至pET28a構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-ompT。以該質(zhì)粒為基礎(chǔ),引入點(diǎn)突變Asp85Ala。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3),經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后OmpT及其突變體以包涵體形式大量表達(dá)。純化后的蛋白經(jīng)梯度透析復(fù)性,并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)恢復(fù)蛋白酶活性。
　　 7、OmpT及其點(diǎn)突變體的酶活鑒定
　　 (1)RMCK分別與OmpT及其點(diǎn)

16、突變體37℃孵育,取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,觀察RMCK是否被OmpT水解成多個小片段。
　　 (2)取抗菌肽魚精蛋白分別與OmpT及其點(diǎn)突變體共同孵育,再分別加入COTD中,同時設(shè)立COTD,COTD與魚精蛋白孵育兩組作為對照,利用光學(xué)顯微鏡觀察四組COTD形態(tài)的差異,描繪四組COTD的生長曲線圖,觀察不同處理下COTD生長之間的差異。
　　 三、結(jié)果：
　　 1、Red重組ompT基因敲除體的構(gòu)建以及生長

17、能力測定
　　 利用Red同源重組系統(tǒng),構(gòu)建ompT基因敲除株。在敲除子的PCR擴(kuò)增和純化中,得到大小為1602 bp的片段,與預(yù)測的片段大小一致。經(jīng)測序證明敲除子的基因序列符合預(yù)期?？敲顾乜剐云桨逄暨x出14個克隆編號并進(jìn)行正向和反向篩選。正向篩選中第1,2,3,4,12,14號克隆的PCR片段為2066 bp,與預(yù)期的正確敲除體克隆大小一致。反向篩選中,第1,2,3,4,12,14號克隆的PCR片段無567 bp長度的PCR

18、片段擴(kuò)增,與預(yù)期一致。最后選取第2、3號克隆的正向篩選PCR產(chǎn)物,用兩側(cè)擴(kuò)增引物進(jìn)行測序。測序結(jié)果:第2、3號克隆基因組上ompT基因ORF區(qū)域按設(shè)計(jì)完全敲除；CFT073本身的基因組序列在測序范圍內(nèi)未發(fā)生任何突變；插入序列有若干點(diǎn)突變,是敲除子(打靶序列)構(gòu)建過程中由PCR反應(yīng)隨機(jī)帶入。敲除株COTD構(gòu)建成功。
　　 根據(jù)生長曲線圖和菌落形成的測定,CFT073和COTD的生長曲線基本一致,且菌落形成能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

19、　　 2、ompT基因的敲除降低切UPEC體外黏附和侵襲能力
　　 根據(jù)COTD及其野生株CFT073和回補(bǔ)株COTD(pST)體外黏附和侵襲人膀胱癌上皮細(xì)胞5637,用菌落數(shù)計(jì)算細(xì)菌的黏附率和侵襲率,多個獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示,黏附率:x2=39.133,v=2,P<0.001；侵襲率:x2=34.527,v=2,P<0.001。可認(rèn)為三種菌株間的黏附率和侵襲率間差異有顯著性意義。野生株黏附率的平均秩次為38.00

20、,突變株為8.00,回補(bǔ)株為23.00。野生株侵襲率的平均秩次為35.93,突變株為8.00,回補(bǔ)株為25.07。野生株的黏附率和侵襲率都比突變株高。且回補(bǔ)株的黏附率和侵襲率都有恢復(fù)。
　　 野生株CFT073、敲除株COTD以及回補(bǔ)株COTD(pST)的紅細(xì)胞凝集抗原效價平均秩次均為14.00；紅細(xì)胞凝集反應(yīng)均被D-甘露糖抑制。多個獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)表明差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明ompT基因?qū)Β裥途谋磉_(dá)沒有明顯影響。

21、　　 3、ompT基因敲除降低UPEC體內(nèi)侵襲能力并抑制IBC的膨出
　　 將野生株與敲除株體內(nèi)侵襲的細(xì)菌數(shù)用SPSS13.0進(jìn)行多個獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。分析結(jié)果顯示,x2=18.063,v=2,P<0.001,組間差異有顯著性意義。野生株體內(nèi)侵襲細(xì)菌數(shù)的平均秩次為19.89,突變株為5.00,回補(bǔ)株為17.11。表明ompT基因敲除后細(xì)菌侵襲進(jìn)入膀胱細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量顯著減少,回補(bǔ)了基因ompT以后體內(nèi)侵襲能力提高。病理切片HE染

22、色顯示野生株與回補(bǔ)株的IBCs多見數(shù)個相連,突變株的IBCs多單個存在,膨出程度也受到抑制。
　　 4、成功表達(dá)OmpT及其點(diǎn)突變體及其酶活測定
　　 成功表達(dá)純化OmpT及其點(diǎn)突變蛋白,并對酶活進(jìn)行鑒定。RMCK與OmpT孵育后被水解成數(shù)個小片段。未與OmpT孵育的魚精蛋白,迅速殺死COTD,肉眼見COTD漂浮死亡,鏡下觀察細(xì)菌成片聚集,COTD生長在6 h內(nèi)被抑制。而加入OmpT孵育后,魚精蛋白未對COTD造成影響。

23、與OmpT點(diǎn)突變體孵育的魚精蛋白同樣殺死COTD并抑制其生長。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 菌落形成能力測定用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)方法分析,細(xì)菌黏附侵襲實(shí)驗(yàn),HA試驗(yàn)以及體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均方差不齊,故均采用多個獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(K Independent Samples Test)。
　　 五、結(jié)論：
　　 1、ompT基因?qū)PEC體內(nèi)外黏附侵襲能力