F18+大腸桿菌鞭毛與其致病相關(guān)性的研究.pdf

1、F18+大腸桿菌病原菌易引起斷奶仔豬的腹瀉、生長(zhǎng)遲緩和死亡，從而給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但遺憾的是至今仍沒(méi)有效的疫苗和防治措施。F18+大腸桿菌引起仔豬感染的致病機(jī)理，目前認(rèn)為F18菌毛和毒素是其已知的兩個(gè)毒力因子，其中F18菌毛介導(dǎo)其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，毒素則是通過(guò)增加分泌和減少吸收來(lái)改變腸細(xì)胞的功能而發(fā)揮致病作用。通常認(rèn)為鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，為細(xì)菌提供運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力，但近年來(lái)的研究陸續(xù)證明其與病原菌的致病力相關(guān)。通過(guò)試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)F1

2、8ab和F18ac大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株都具有良好的運(yùn)動(dòng)性，而至今有關(guān)F18+大腸桿菌致病機(jī)理研究的模型中都未曾提到過(guò)鞭毛在其中的作用。本研究以鞭毛為切入點(diǎn)來(lái)探討F18+大腸桿菌鞭毛與其致病性之間的關(guān)系。
　　 基于編碼F18+大腸桿菌鞭毛素的fliC基因、編碼F18菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基的fedA基因和編碼鞭毛馬達(dá)的motA基因的已知序列，本試驗(yàn)利用λ噬菌體-Red同源重組系統(tǒng)對(duì)F18+大腸桿菌的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株F18ab(Wild-type，O

3、139∶H1:F18ab，Stx2e)和F18ac(Wild-type，O157∶H19∶F18ac，4P-，STa+，STb+)的上述基因進(jìn)行敲除。首先將含有fliC，fedA和motA基因同源臂片段和Cat（氯霉素抗性基因）表達(dá)盒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化至已經(jīng)轉(zhuǎn)化有pKD46質(zhì)粒的F18ab和F18ac大腸桿菌中，在Red同源重組酶的作用下，借助兩端與靶基因兩翼同源的序列與染色體上對(duì)應(yīng)區(qū)域發(fā)生重組，實(shí)現(xiàn)一步法構(gòu)建F18ab/ac△f

4、liC∷Cat，F(xiàn)18ab/ac△fedA∷Cat和F18ab/ac△motA∷Cat突變株。在二次重組中利用溫度敏感性、編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，從而消除Cat抗性基因標(biāo)志。通過(guò)PCR鑒定及DNA測(cè)序結(jié)果證明了上述缺失株的成功構(gòu)建。在表型試驗(yàn)中，其fliC缺失株在半固體培養(yǎng)基上缺乏運(yùn)動(dòng)性、電鏡下觀察無(wú)鞭毛形態(tài)和用WesternBlot檢測(cè)不到鞭毛素的表達(dá)。motA缺失株細(xì)菌表面雖能觀察到鞭毛形態(tài)但在半固體培養(yǎng)基上缺乏運(yùn)動(dòng)性。f

5、edA缺失株不能與F18ab單克隆抗體發(fā)生可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。FliC和fedA雙缺失株是在△fliC缺失株的基礎(chǔ)上利用同源重組系統(tǒng)繼續(xù)缺失fedA基因構(gòu)建而成的。該雙缺失株既不能在半固體培養(yǎng)基上運(yùn)動(dòng)也不能與F18菌毛的多克隆抗體發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。fliC、fedA、motA及fliCfedA基因缺失株的成功構(gòu)建，有助于深入研究F18+大腸桿菌的致病機(jī)理。
　　 通常，細(xì)菌對(duì)腸上皮細(xì)胞起初的黏附及后續(xù)的定植被認(rèn)為是腸道疾病發(fā)病

6、機(jī)制中關(guān)鍵的第一步。盡管鞭毛介導(dǎo)了多種病原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，但還不清楚其是否在F18+大腸桿菌黏附宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究通過(guò)比較鞭毛缺失株、F18菌毛缺失株、motA缺失株及鞭毛和F18菌毛雙缺失株與野生株對(duì)兩個(gè)體外仔豬腸上皮細(xì)胞，IPEC-1和IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力發(fā)現(xiàn)，鞭毛缺失株及鞭毛和F18菌毛雙缺失株對(duì)上述兩個(gè)細(xì)胞系的黏附能力都顯著下降(P＜0.05)，而F18菌毛缺失株的黏附能力并無(wú)明顯的變化。當(dāng)把編碼鞭毛馬

7、達(dá)的motA基因缺失后構(gòu)建了有鞭毛形態(tài)但不能運(yùn)動(dòng)的F18+大腸桿菌菌株，其黏附能力同樣也下降，說(shuō)明鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性在F18+大腸桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附過(guò)程中同樣起重要的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，1:10的多克隆H1或H19抗體分別能抑制隨后F18ab或F18ac大腸桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，而用間接免疫熒光試驗(yàn)證明純化的鞭毛也能直接與腸上皮細(xì)胞結(jié)合。以上結(jié)果都說(shuō)明了F18+大腸桿菌鞭毛本身具有黏附特性。另外，通過(guò)熒光定量PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鞭毛缺失

8、后能使Ⅰ型菌毛的表達(dá)量增加了約2倍，F(xiàn)18菌毛及AIDA-Ⅰ分別增加了約1.3和1.4倍，從而揭示了細(xì)菌菌體表面的各附屬結(jié)構(gòu)是協(xié)調(diào)表達(dá)的。
　　 以上結(jié)果證明了F18+大腸桿菌鞭毛介導(dǎo)了其起初對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。鞭毛在介導(dǎo)黏附時(shí)，主要通過(guò)兩方面發(fā)揮作用。一方面，鞭毛通過(guò)其運(yùn)動(dòng)性，非特異性的增加F18+大腸桿菌與宿主細(xì)胞之間相互接觸的機(jī)率，從而促進(jìn)黏附。另一方面，鞭毛本身能作為一種黏附素，直接特異性地與宿主細(xì)胞上的鞭毛受體結(jié)合而參與

9、黏附。
　　 鞭毛及鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性是許多具有侵襲能力的致病菌的重要侵襲因子。通過(guò)研究F18abE.coli和F18acE.coli對(duì)IPEC-J2和IPEC-1細(xì)胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)，和其他的ETEC一樣，F(xiàn)18acE.coli沒(méi)有侵襲能力，而F18abE.coli對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞都具有侵襲能力。與野生株相比，E.coliF18ab△fliC對(duì)IPEC-J2和IPEC-1細(xì)胞的侵襲能力都顯著下降。其中fliC缺失后使F18abE.co

10、li對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的侵襲減少了約91％，對(duì)IPEC-1細(xì)胞的侵襲也減少了約63％?；貜?fù)株的侵襲能力得到了部分恢復(fù)。在37℃時(shí)F18abE.coli鞭毛的表達(dá)量比在30℃時(shí)更多，其侵襲能力也更強(qiáng)。本研究首次發(fā)現(xiàn)了F18abE.coli具有侵襲能力，并證明鞭毛是其重要的侵襲因子。
　　 細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌為了適應(yīng)不良的生存環(huán)境，而與處于浮游狀態(tài)的單個(gè)細(xì)菌相對(duì)的一種生存方式。大多數(shù)致病菌在一定的條件下都能形成生物被膜。在本研究中

11、我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)18abE.coli和F18acE.coli在體外都具有形成生物被膜的能力，且F18abE.coli形成生物被膜的能力比F18acE.coli強(qiáng)。鞭毛及鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性是影響生物被膜形成的重要因素之一。與野生株相比，F(xiàn)18abE.coli鞭毛缺失株在IPEC-J2細(xì)胞上只能形成小的微菌落，在試管中形成生物被膜的能力也減弱。而即使是野生型F18acE.coli在IPEC-J2細(xì)胞上形成的微菌落也比較少，與此相應(yīng)的在試管中形成生

12、物被膜能力也較弱。當(dāng)鞭毛缺失后，其在試管中僅能形成很薄的一層生物被膜。通過(guò)生物被膜定量試驗(yàn)進(jìn)一步證明，鞭毛缺失后使F18abE.coli和F18acE.coli形成生物被膜的能力都顯著下降。以上結(jié)果說(shuō)明了鞭毛在F18+E.coli體外生物被膜和微菌落形成中起重要的作用。
　　 單體的細(xì)菌鞭毛素蛋白能通過(guò)Toll-likereceptor5(TLR5)信號(hào)途徑誘導(dǎo)機(jī)體促炎性細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)生。本研究通過(guò)比較F18+E.coli

13、fliC缺失株、fedA缺失株及fliCfedA雙缺失株在體外Caco-2細(xì)胞模型中引起IL-8產(chǎn)生的能力發(fā)現(xiàn)，所有的這些缺失株誘導(dǎo)IL-8產(chǎn)生的濃度都下降。FliC缺失株誘導(dǎo)IL-8產(chǎn)生的能力減少了約68％，fedA缺失株減少了約43％，而fliCfedA雙缺失株則減少了約86％。以上結(jié)果說(shuō)明了鞭毛素蛋白是F18+E.coli在體外誘導(dǎo)誘導(dǎo)IL-8產(chǎn)生的主要因素，也首次證明了F18菌毛在體外也能誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生。
　　 總之