蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)在前房相關(guān)免疫偏離和Behcet病中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分：無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)篩選前房相關(guān)免疫偏離小鼠脾CD4+T細(xì)胞的差異蛋白 目的：可溶性蛋白抗原注入眼前房后能誘導(dǎo)出一種全身性的免疫耐受，稱為前房相關(guān)免疫偏離(anteriorchamber—associatedimmunedeviationACAID)。ACAID的主要特點(diǎn)為抗原特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed—typehypersensitivity，DTH)受抑制和補(bǔ)體結(jié)合性抗體缺失。如果生物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了對(duì)抗原的耐受反

2、應(yīng)，那么機(jī)體就不會(huì)產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。這可以解釋為什么一部分人不易患葡萄膜炎而其他人易患葡萄膜炎。所以研究ACAID的形成機(jī)制，就能為治療葡萄膜炎提供依據(jù)。CD4+T細(xì)胞參與了ACAID的形成，但是這些細(xì)胞內(nèi)有哪些蛋白起作用，知之甚少。無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是需要的樣本量相對(duì)較少(與傳統(tǒng)的雙向電泳相比)，適用于和本實(shí)驗(yàn)一樣標(biāo)本量較少的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)利用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的蛋白進(jìn)行相對(duì)定量和鑒定，以期找到參與ACAID形成的新蛋白。

3、 方法：用BALB/c鼠誘導(dǎo)ACAID模型。僅OVA足底皮下免疫為陽(yáng)性組(positivegroup)，無(wú)處理小鼠作為正常組。分離小鼠脾CD4+T細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的蛋白進(jìn)行相對(duì)定量和鑒定。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)量變化在兩倍以上的蛋白質(zhì)：陽(yáng)性組和ACAID組對(duì)比有43個(gè)；正常組和ACAID組對(duì)比96個(gè)，分別參與了細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞活動(dòng)如：蛋白質(zhì)合成，三大物質(zhì)代謝，細(xì)胞循環(huán)，DNA復(fù)

4、制，組裝和修復(fù)等。其中和免疫有密切關(guān)系的蛋白有PP2Ac(正常組：ACAID組=6.11)和proflin-1(正常組：ACAID組=8.16)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大量未在ACAID中研究過(guò)的蛋白質(zhì)，說(shuō)明無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)是一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選技術(shù)，可以作為ACAID的一種研究手段。PP2Ac和proflin-1在ACAID行程中可能起重要作用。 第二部分：雙向電泳篩選Vogt—小柳原田綜合征和Behcet病血清的差異

5、蛋白 目的：Vogt—小柳原田綜合征(VKH綜合征)主要表現(xiàn)肉芽腫性全葡萄膜炎，常伴有腦膜刺激征、聽(tīng)覺(jué)障礙、皮膚和毛發(fā)改變等全身性表現(xiàn)。Behcet病(BD)主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的非肉芽腫性葡萄膜炎、口腔潰瘍、皮膚損害、生殖器潰瘍等為特征的多系統(tǒng)炎癥性自身免疫性疾病。這兩種疾病的病因和發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚。本研究利用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜的方法篩選VKH綜合征和Behcet病患者血清中特異性表達(dá)蛋白，為葡萄膜炎發(fā)生機(jī)制的研究提供新思路并

6、為其臨床診斷提供新的依據(jù)。 方法：收集8例活動(dòng)期VKH綜合征患者血清，8例BD患者血清和8例健康人血清，每組按等體積混合為一個(gè)樣本。去除其中高豐度的白蛋白和免疫球蛋白，用雙向電泳方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，膠內(nèi)蛋白通過(guò)“藍(lán)銀”染色法染色，經(jīng)定量比較篩選出在患者和健康人血清雙向電泳圖譜中表達(dá)存在顯著差異的蛋白斑點(diǎn)。經(jīng)MALDI—TOF—TOF質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。另收集18例活動(dòng)期BD病患者、6例靜止期BD病患者、22例活動(dòng)期VKH綜合征患者和

7、20例健康志愿者的血清用Westernblot和ELISA方法驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果。 結(jié)果：在VKH綜合征患者血清中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)量有明顯差異的蛋白，但是BD患者電泳圖譜中的蛋白斑點(diǎn)經(jīng)定量比較共篩選出6個(gè)蛋白斑點(diǎn)在患者和健康人血清中表達(dá)存在顯著差異。其中4個(gè)蛋白斑點(diǎn)經(jīng)MALDI—TOF—TOF質(zhì)譜分析共鑒定出2種蛋白，分別是結(jié)合珠蛋白(Hp)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)，在活動(dòng)期BD病患者血清中表達(dá)量均上調(diào)，Hp和SAA用Weste

8、rnblot方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，Hp在活動(dòng)期BD病患者血清中的表達(dá)顯著高于活動(dòng)期VKH綜合征患者和健康人，但個(gè)體差異較大，表達(dá)量平均約高出2倍。SAA在活動(dòng)期BD病患者血清中表達(dá)顯著高于活動(dòng)期VKH綜合征患者和健康人。我們用ELISA方法對(duì)Hp的表達(dá)情況作進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果證明Hp在活動(dòng)期BD病患者血清中表達(dá)顯著高于活動(dòng)期VKH綜合征患者和健康人。ELISA的結(jié)果與Westernblot的結(jié)果相一致。 結(jié)論：本研究進(jìn)一步證實(shí)雙