基于iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選螺旋藻形態(tài)建成相關(guān)蛋白.pdf

1、螺旋藻形態(tài)是衡量螺旋藻品質(zhì)的重要因素，但螺旋藻在培養(yǎng)過(guò)程中易受到外界環(huán)境的影響，形態(tài)發(fā)生改變，并伴隨一系列生理學(xué)，營(yíng)養(yǎng)學(xué)，遺傳學(xué)和蛋白組學(xué)等的相應(yīng)變化，不僅藻種產(chǎn)量大幅度下降，而且為藻種的鑒定帶來(lái)了困難。因此為實(shí)現(xiàn)對(duì)螺旋藻形態(tài)變化的改良和調(diào)控，有必要解析螺旋藻形態(tài)建成的分子機(jī)理。
　　本研究以來(lái)源于單藻絲培養(yǎng)物中發(fā)生形態(tài)分化的直線形和螺旋形個(gè)體為對(duì)象，利用iTRAQ蛋白組學(xué)和質(zhì)譜分析技術(shù)，探討其蛋白質(zhì)組的差異變化，獲得與螺旋藻形態(tài)

2、建成相關(guān)的差異蛋白，并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)篩選到的差異蛋白從參與的生物過(guò)程、細(xì)胞定位、分子功能三方面進(jìn)行分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)所得到的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)從轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行驗(yàn)證，旨在找到調(diào)控螺旋藻形態(tài)建成的關(guān)鍵基因，揭示螺旋藻形態(tài)建成的分子機(jī)理及代謝調(diào)控機(jī)制。試驗(yàn)研究結(jié)果如下：
　　1.分別對(duì)直線形和螺旋形螺旋藻的藻絲體長(zhǎng)度、螺徑、螺距、螺旋數(shù)及生長(zhǎng)曲線、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、葉綠素a、類(lèi)胡蘿卜素等形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，

3、掌握不同形態(tài)螺旋藻之間的形態(tài)及生理指標(biāo)差異，為后續(xù)研究對(duì)象的選擇提供充分的依據(jù)。
　　2.通過(guò)iTRAQ蛋白組學(xué)及質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)與螺旋藻形態(tài)建成相關(guān)蛋白進(jìn)行篩選鑒定。以FDR≤1％，去除反庫(kù)數(shù)據(jù)和比值為空白的無(wú)效值，作為可信蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)；蛋白豐度倍數(shù)變化大于2(上調(diào)表達(dá))或小于0.5(下調(diào)表達(dá))，作為差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)。iTRAQ-LC-MS/MS分析共匹配到185123個(gè)圖譜，譜圖利用率為37.6%，去除可信度較低的肽段，共鑒定到3

4、0508個(gè)特定肽段，根據(jù)可信蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)，去掉冗余結(jié)果，最終鑒定到2156個(gè)蛋白。TJSD2/TJSD3組共篩選出165個(gè)差異蛋白，TJBC4-1/TJBC4-2組中共篩選出167個(gè)差異蛋白，兩組共有的差異表達(dá)蛋白35個(gè)。
　　3.對(duì)篩選的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鑒定的差異蛋白參與糖酵解TCA循環(huán)，光合作用，光合作用-天線蛋白，淀粉與蔗糖代謝，脂多糖生物合成，光合生物固碳，卟啉，葉綠素代謝等多種代謝調(diào)控。通過(guò)對(duì)代謝途徑的分析，

5、構(gòu)建了螺旋藻形態(tài)建成預(yù)測(cè)模型，用于初步解析螺旋藻形態(tài)建成機(jī)理。并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)模型中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。以蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析具有相同變化趨勢(shì)的蛋白質(zhì)為依據(jù)，構(gòu)建了螺旋藻形態(tài)建成中心能量代謝網(wǎng)絡(luò)圖，解析了蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)。
　　4.通過(guò)對(duì)兩組螺旋藻中的共性差異蛋白進(jìn)行分析，對(duì)螺旋藻形態(tài)建成起關(guān)鍵作用的pgm基因，進(jìn)行原核表達(dá)驗(yàn)證。構(gòu)建pgm基因的融合表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)入螺旋藻pgm基因的大腸桿