采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白.pdf

1、背景：浸潤性生長和轉(zhuǎn)移潛能是惡性腫瘤不同于良性腫瘤的根本特征，是惡性腫瘤頑固性和難治性的根本原因。由轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的惡性腫瘤患者死亡率高、預(yù)后差及其發(fā)生機(jī)制不清，長期以來一直是腫瘤學(xué)研究面臨的難題之一。由上皮來源的惡性腫瘤，淋巴道轉(zhuǎn)移是其早期轉(zhuǎn)移的主要方式，因此對(duì)于淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)鍵分子機(jī)制和通路，并建立起一套行之有效的針對(duì)性阻遏手段，將對(duì)惡性腫瘤患者具有重要的現(xiàn)實(shí)意義．。Hca-F和Hca-P是一對(duì)來源于同一親本細(xì)

2、胞、且淋巴道轉(zhuǎn)移潛能顯著不同的小鼠肝癌腹水型細(xì)胞株，其中Hca-F為高淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞株(>70﹪)，Hca-P 為低淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞株(<30﹪)，二者在腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制研究中互為參照，是難得而有效的細(xì)胞模型。我們已應(yīng)用基因芯片等高通量技術(shù)手段，在mRNA水平對(duì)Hca-F細(xì)胞株和Hca-P細(xì)胞株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)二者有明顯差異的基因表達(dá)。但是從mRNA水平進(jìn)行研究，只包括了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，不但在豐度上不能反應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，而且蛋白質(zhì)

3、復(fù)雜的翻譯后修飾、亞細(xì)胞定位和遷移、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用等，也幾乎無法從mRNA水平來判斷。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對(duì)蛋白質(zhì)的研究將直接闡明生命在生理和病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)一個(gè)細(xì)胞或組織的基因組所包含的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行的研究。但由于技術(shù)方法限制及蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)空差異，很難分離和得到表達(dá)的所有蛋白。因此發(fā)展可靠高通量的技術(shù)手段，將會(huì)推進(jìn)對(duì)蛋白質(zhì)組的研究。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，以雙向凝膠電泳和質(zhì)譜為基礎(chǔ)

4、的蛋白質(zhì)組學(xué)分離和鑒定技術(shù)迅速發(fā)展起來。 目的：本研究應(yīng)用近年來發(fā)展起來的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——熒光差異雙向凝膠電泳，在蛋白質(zhì)水平對(duì)高、低淋巴道轉(zhuǎn)移力小鼠肝癌腹水型細(xì)胞株Hca-F和Hca-P基因表達(dá)進(jìn)行比較研究，建立相應(yīng)的熒光差異雙向凝膠電泳蛋白表達(dá)圖譜，并對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，以篩選肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，為進(jìn)一步闡明淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：將凍存的Hca-F與Hca-P細(xì)胞株復(fù)蘇后，進(jìn)行細(xì)

5、胞培養(yǎng)。以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察二者在615小鼠的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。提取總蛋白的瘤細(xì)胞洗滌后，冷凍離心機(jī)離心，取沉淀加入細(xì)胞裂解液，并在冰浴下超聲破碎。冷凍離心機(jī)離心后，提取上清。采用蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，測定樣品蛋白濃度。蛋白的熒光標(biāo)記按照廠家介紹的步驟進(jìn)行，cy3(cy5)染料分別交叉標(biāo)記Hca-F(Hca-P)細(xì)胞提取的蛋白，Cy2染料標(biāo)記總量相同，但Hca-F細(xì)胞和Hca-P細(xì)胞各1/2量蛋白。與緩沖液及IPG泡漲液混合，制成一向等電聚焦體系。

6、在該體系中重泡漲IPG干膠條10個(gè)小時(shí)后，按照操作說明使用IPGph Ⅱ電泳儀，以50mA電流等電聚焦76KVh。等電聚焦結(jié)束的IPG膠條平衡后，進(jìn)行12.5﹪SDS-PAGE電泳。雙向凝膠電泳結(jié)束后，應(yīng)用Typhoon<'TM>9400成像系統(tǒng)掃描成像。采用Decyder軟件DIA和BVA模式，進(jìn)行凝膠圖像分析。不同凝膠內(nèi)分析模式采用配對(duì)比較，以Cy2為內(nèi)標(biāo)計(jì)算比值，通過Cy3/Cy2及Cy5/Cy2的比率對(duì)應(yīng)每個(gè)蛋白點(diǎn)含量;并對(duì)其進(jìn)

7、行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。重復(fù)4塊膠用來計(jì)算每個(gè)蛋白點(diǎn)平均量的改變，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算p值，設(shè)定p<0.05為有顯著性差異。經(jīng)DeCyder軟件分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)自動(dòng)蛋白質(zhì)點(diǎn)切割機(jī)切取后，轉(zhuǎn)移至96孔板中，進(jìn)行胰蛋白酶膠內(nèi)酶解，然后用于電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，通過Sequest軟件檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。以蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證差異蛋白質(zhì)Erp29和UCHL3的表達(dá)水平。對(duì)鑒定出的差異性蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)的功能分析，所使用的分析

8、系統(tǒng)為DAVID和PANTHER，分別從蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)位置、分子功能、生物學(xué)過程以及代’謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上進(jìn)行分析。 結(jié)果：Hca-F細(xì)胞株和Hca-P細(xì)胞株的成瘤率100﹪，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別為75﹪和25﹪，兩者相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性意義(p<0.05=,符合本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞模型的要求。建立Hca-P和Hca-F細(xì)胞株的蛋白質(zhì)熒光差異雙向凝膠電泳蛋白表達(dá)圖譜。經(jīng)分析，Hca-F和Hca-P樣品問有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)共

9、163個(gè)，其中比值改變2倍以上的差異性點(diǎn)23個(gè)；1.5倍～2倍的差異性點(diǎn)79個(gè)；1倍～1.5倍差異性點(diǎn)61個(gè)。在Hca-F細(xì)胞中上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為86個(gè)，下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為77個(gè)。將這些差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜圖后應(yīng)用Sequest軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中檢索，共得到168種蛋白質(zhì)，其中2倍以上差異性蛋白質(zhì)有纈酪肽蛋白(vcp)、真核翻譯延長因子2(Eef2)、轉(zhuǎn)羥乙醛酶(Tkt)、M2型丙酮酸激酶(Pkm2)、

10、預(yù)測的谷氨酰胺酶異構(gòu)體5(Gls)、Erol樣蛋白(Erol)、Aldh2蛋白(Aldh2)、假定蛋白LOC192169(1810047C23 Rik)、RuvB樣蛋白、 (Ruvbll)、真核翻譯延長因子1α2 (Eeflα2)、波形蛋白(Vim)、外周蛋白(Prph)、結(jié)蛋白(Des)、膜聯(lián)蛋白7(Anxa7)、腦肌酸激酶(Ckb)、線粒體蘋果酸脫氫酶2 (Mdh2)、膜聯(lián)蛋白5(Anxa5)、過氧化物酶體的烯酰輔酶A水解酶1 (E

11、chl)、不均一核糖核酸A2/BI異構(gòu)體l(Hnrpa2b1)、內(nèi)酰胺酶β2(Lactb2)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ol(GSTol)、泛素C末端水解酶同工酶L3 (UCHL3)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29前體，(ERp29)、溶血磷脂酶1 (Lyplal)、Crk蛋白(Crk)、微管不穩(wěn)定蛋白(Stmnl)。蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證差異性蛋白，其結(jié)果表明Erp29和UCHL3在Hca-P細(xì)胞中均高表達(dá)，與鑒定結(jié)果一致。對(duì)全部168個(gè)差異性蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析

12、，在細(xì)胞成分分析中，差異性蛋白質(zhì)多位于細(xì)胞器，其中以線粒體、細(xì)胞骨架、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)居多；分子功能分析顯示，差異性蛋白質(zhì)涉及分子伴侶、細(xì)胞骨架蛋白、水解酶、裂解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核苷酸結(jié)合蛋白、氧化還原酶、蛋白酶、選擇性鈣離子結(jié)合、選擇性調(diào)節(jié)分子、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)移酶等功能，其中具有核苷酸結(jié)合蛋白分子功能的蛋白質(zhì)最多占19.4﹪，其次為氧化還原酶及細(xì)胞骨架蛋白各占12.1﹪；生物過程分析顯示這些差異性蛋白參與到各種生物學(xué)過程中，其中主要參與到蛋白質(zhì)代謝

13、和修飾的蛋白質(zhì)占29.1﹪，核酸及核苷酸代謝的蛋白質(zhì)占16.4﹪，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和移動(dòng)的蛋白質(zhì)占12.7﹪，免疫和防御的蛋白質(zhì)占12.1﹪；代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分析顯示上述差異性蛋白涉及精氨酸與脯氨酸代謝、糖酵解和糖異生、碳固定、細(xì)胞交流、肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)、黏著斑、抗原的加工和提呈等代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)論：以高低淋巴道轉(zhuǎn)移力小鼠肝癌細(xì)胞株Hca-F和Hca-P為研究對(duì)象，采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——熒光差異雙向凝膠電泳，建立了高低淋巴道轉(zhuǎn)移力

14、小鼠肝癌細(xì)胞熒光差異蛋白表達(dá)圖譜，高通量篩選與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白。共得到163個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，在高淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞株Hca-F中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為86個(gè)，在低淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞株Hca-P中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為77個(gè)。以質(zhì)譜技術(shù)分析及數(shù)據(jù)庫搜索共鑒定出168種蛋白質(zhì)，對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，分別從這些蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)位置、分子功能、生物學(xué)過程以及代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示差異性蛋白質(zhì)多位于細(xì)胞