同型半胱氨酸對血栓調(diào)節(jié)蛋白基因甲基化修飾及其與腦梗死發(fā)病的關(guān)系.pdf

1、背景與目的:
　　腦血管病目前已經(jīng)成為我國城鄉(xiāng)居民死因之首，也是單病種致殘率最高的疾病，腦梗死(Cerebral infarction，CI)是腦血管病中最常見者。腦梗死是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用導(dǎo)致的多因素疾病，而表觀遺傳學(xué)則是聯(lián)系環(huán)境因素與遺傳因素的橋梁。DNA甲基化是目前最常見，也是研究最透徹的表觀遺傳修飾形式，能夠抑制基因表達(dá)，導(dǎo)致其生物學(xué)功能缺失，且這種表觀遺傳方式具有可逆性、可遺傳性。高同型半胱氨酸血癥(Hyp er

2、homocysteinemia，HHcy)被認(rèn)為是腦梗死的獨(dú)立危險因素，其通過甲硫氨酸循環(huán)產(chǎn)生S-腺苷甲硫氨酸，后者作為DNA甲基化的唯一甲基供體來改變易感基因甲基化狀態(tài)，進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin，TM)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的膜糖蛋白，作為凝血酶受體，其具有抗凝、促纖溶、抗炎等功能，在預(yù)防腦梗死發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。已有研究顯示冠心病患者外周血血栓調(diào)節(jié)蛋白基因啟動子區(qū)發(fā)生異常高甲基化，但

3、未見其與腦梗死的相關(guān)性研究。奉研究通過探討血栓調(diào)節(jié)蛋白基因啟動子區(qū)異常甲基化改變在高同型半胱氨酸血癥致腦梗死形成中的作用，從表觀遺傳學(xué)角度探討同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)作為腦梗死獨(dú)立危險因素的致病機(jī)理，為防治腦梗死提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法:
　　采取病例-對照研究，入選120例腦梗死患者和80例對照，腦梗死患者來源于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2013年5月～2014年11月的住院患者，均符

4、合全國第四屆腦血管病會議修訂的標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)CT或MRI檢查證實(shí)有新發(fā)腦梗死病灶;對照為健康體檢者和同期住院的良性陣發(fā)性位置性眩暈、偏頭痛患者，病史及體格檢查中無腦血管病證據(jù)和（或）頭顱CT/MRI正常者。記錄所有研究對象臨床資料及高危因素。所有腦梗死患者均接受顱腦MRI檢查，并記錄梗死灶大小，采用美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分(National institutes ofhealth stroke scale，NIHSS)評價神經(jīng)功能缺損

5、嚴(yán)重程度。所有研究對象抽取肘靜脈血，提取基因組DNA，采用巢式甲基特異性PCR分析TM啟動子區(qū)甲基化狀態(tài);提取血液總RNA，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測TM mRNA;采用ELISA法測定血漿可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(soluble Thrombomodulin，sTM)水平;熒光生化法檢測血漿Hcy濃度。所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0軟件處理。
　　結(jié)果:
　　(1)腦梗死組與對照組相比，年齡、性別、甘油三酯之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，膽

6、固醇、吸煙及飲酒者所占比例、合并高血壓及糖尿病的比例之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2) TM基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)包括非甲基化、部分甲基化和完全甲基化三種。腦梗死組TM基因啟動子區(qū)甲基化率(74.2％)明顯高于對照組(47.5％)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=14.724，p=0.00);頭顱MRI彌散相測得腦梗死組梗死灶直徑為3.32±2.49cm，依據(jù)其大小將腦梗死患者分為大面積腦梗死組、中等腦梗死組與腔隙性腦梗死組三個亞組，

7、其甲基化率分別為90.3％，76.2％，61.7％，隨著梗死病灶擴(kuò)大，TM基因甲基化率有逐漸增加趨勢，但僅大面積腦梗死組與腔隙性腦梗死組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=7.777，p=0.005)，大面積腦梗死組與中等面積腦梗死組、中等面積腦梗死組與腔隙性腦梗死組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;腦梗死組入院后24小時內(nèi)NIHSS評分為6.55±4.25分，與TM基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行spearman秩相關(guān)分析，二者呈正相關(guān)(r=0.462，p=0.

8、00)。
　　(3)腦梗死患者血漿Hcy濃度（14.31±4.61μmol/L）明顯高于對照組（10.25±2.97μmol/L），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.566，p=0.00）。在腦梗死組，TM基因啟動子區(qū)甲基化程度與血漿Hcy濃度呈高度正相關(guān)（r=0.701，p=0.00）。
　　(4)將腦梗死患者TM基因甲基化狀態(tài)與各種腦血管病高危因素進(jìn)行二元logistic相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)年齡（OR=2.097，p=0.031）、吸

9、煙（OR=3.091，p=0.027）是腦梗死患者TM基因甲基化狀態(tài)的影響因素，而性別、飲酒、血糖與LDL不是腦梗死患者TM基因甲基化狀態(tài)的影響因素。
　　(5)腦梗死患者TM mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組，為對照組的27％，腦梗死組按照TM基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)分組，非甲基化組、部分甲基化組、完全甲基化組TM mRNA表達(dá)水平逐漸降低，分別為對照組的64％、25％、12％，TM mRNA表達(dá)水平與其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)呈高度負(fù)相

10、關(guān)(r=-0.711，p=0.00)。
　　(6)給予50例腦梗死合并高同型半胱氨酸血癥患者口服維生素B6、甲鈷胺、葉酸治療12周，治療后血漿Hcy濃度（12.36±2.80μmol/L）較治療前（19.02±2.44μmol/L）明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.314，p=0.00）;治療后TM基因啟動子區(qū)完全甲基化率(42％)較治療前(54％)有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(X2=1.442，p=0.230);治療后TM基

11、因mRNA表達(dá)（0.2514±0.1295）較治療前（0.2149±0.1170）升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.205，p=0.02）。
　　(7)腦梗死患者血漿sTM濃度（4.33±0.84 ng/ml）明顯高于對照組（2.81±40.38 ng/ml），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.268，p=0.00）。腦梗死患者梗死灶直徑為3.32±2.49cm，與其血漿sTM濃度呈正相關(guān)(r=0.611，p=0.00);腦梗死患者入院

12、后NIHSS評分6.55±4.25分，與其血漿sTM濃度呈正相關(guān)(r=0.544，p=0.00)。
　　結(jié)論:
　　(1)腦梗死患者TM基因啟動子區(qū)甲基化率明顯高于對照組，且其與腦梗死患者血漿Hcy濃度呈高度正相關(guān)，與腦梗死灶大小、入院后NIHSS評分呈正相關(guān);與TM mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān);提示Hcy可能通過誘導(dǎo)TM基因啟動子區(qū)高甲基化而使其mRNA表達(dá)減少，降低TM的抗凝、促纖溶、抗炎等功能，進(jìn)而參與腦梗死的發(fā)生、發(fā)展

13、。
　　(2)年齡與吸煙是腦梗死患者TM基因甲基化狀態(tài)的影響因素，而性別、飲酒、血糖與LDL不是腦梗死患者TM基因甲基化狀態(tài)的影響因素。
　　(3)口服葉酸、維生素B12與維生素B612周后能夠明顯降低腦梗死患者血漿Hcy濃度，但逆轉(zhuǎn)其引起的外周血TM基因高甲基化狀態(tài)可能需要更長時間。
　　(4)腦梗死患者血漿sTM水平升高，與其腦梗死灶大小、入院后NIHSS評分呈正相關(guān)，但其sTM水平增高并非TM基因表達(dá)增多所致，而