辛伐他汀對(duì)非灑精性脂肪性肝纖維化的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)和脂肪性肝硬化。在我國(guó)，NAFLD已成為慢性肝病的常見(jiàn)類型。非酒精性脂肪性肝纖維化作為NAFLD發(fā)病的中間階段，其具體發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種保護(hù)性脂肪因子，可通過(guò)活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和激活p38有絲分裂原活化蛋白激酶，發(fā)揮抗炎、

2、改善胰島素抵抗、促進(jìn)脂肪酸氧化等作用。目前研究顯示，脂聯(lián)素具有抗纖維化作用，能夠抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）活化、增殖、遷移，促進(jìn)活化HSC凋亡，但其具體機(jī)制不明。一氧化氮合酶(NOS)是合成一氧化氮的限速酶，脂聯(lián)素能增強(qiáng)內(nèi)皮型NOS(eNOS)的活性，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮。但脂聯(lián)素能否通過(guò)調(diào)節(jié)NOS表達(dá)抑制HSC活化尚不得知。辛伐他汀是臨床常用的降血脂藥物，隨著研究深入，其非降脂作用日益受到重視，如抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞增殖等。研究顯示，

3、辛伐他汀能降低NAFLD患者的血脂水平，減輕肝組織脂肪變性程度，但其能否提高NAFLD患者血清脂聯(lián)素水平、上調(diào)肝組織脂聯(lián)素表達(dá)、抑制或延緩肝纖維化進(jìn)展仍有爭(zhēng)議。因此，本研究應(yīng)用高脂飲食建立非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)血清脂聯(lián)素水平，肝組織脂聯(lián)素、AMPKmRNA和蛋白含量，觀察模型大鼠中脂聯(lián)素、AMPK和NOS的表達(dá)變化及意義；體外培養(yǎng)HSC，明確外源性脂聯(lián)素對(duì)HSC中AMPK、NOS表達(dá)的影響；并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察辛伐他汀

4、對(duì)模型大鼠肝組織及體外培養(yǎng)HSC中脂聯(lián)素、NOS表達(dá)的影響，從整體、組織、細(xì)胞及分子水平探討辛伐他汀對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化的可能作用機(jī)制，為臨床有效防治非酒精性脂肪性肝纖維化提供新的理論依據(jù)及治療靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1、脂聯(lián)素在非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠肝臟中的表達(dá)及意義
　　 健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠40只，體重（150±10）g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。正常喂養(yǎng)1周后隨即分為正常對(duì)照組

5、和模型組，其中正常對(duì)照組大鼠10只，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠30只，以高脂飲食喂養(yǎng)（標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上加2％膽固醇、10％豬油和5％玉米油）。分別于第8、12、16、20、24周末隔夜空腹處死模型組大鼠各6只，迅速采血并留取肝組織標(biāo)本。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定( ELISA)法檢測(cè)血清脂聯(lián)素水平；取部分新鮮肝組織立即冰凍切片

6、，進(jìn)行蘇丹Ⅳ染色以觀察肝組織脂肪變性情況；另取部分肝組織以10％福爾馬林固定并制作石蠟切片，分別行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson三重染色，以觀察肝組織普通病理改變及纖維化程度；余肝組織-80℃保存，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)脂聯(lián)素、AMPK、Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)，用蛋白印記法( Western Blot)測(cè)定脂聯(lián)素、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)變化。
　　 2、脂聯(lián)素抑制肝

7、星狀細(xì)胞活化的分子機(jī)制
　　 人肝星狀細(xì)胞株LX-2細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞接種在六孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，用含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)至70％融合時(shí)換用促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的培養(yǎng)基（adipogenic differentiation mixture，ADM，含10％胎牛血清、1％青鏈霉素、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤、1μM地塞米松和1μM胰島素的低糖DMEM）培養(yǎng)72h，獲

8、得靜止型LX-2細(xì)胞，用含0.2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)并加入溶劑，處理組在常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上分別加入TGF-β1(100pM)、脂聯(lián)素(5μg/ml)、TGF-β1(100pM)+脂聯(lián)素(5μg/ml)、NOS抑制劑L-NAME(100μM)、L-NAME(100μM)+脂聯(lián)素(5μg/ml)處理1h（用于檢測(cè)AMPK表達(dá)情況）或24h．收取細(xì)胞。RT-PCR和Westem Blot法分別檢測(cè)各組LX-

9、2細(xì)胞中AMPK、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)、eNOS、α平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 3、辛伐他汀對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化的治療作用及其機(jī)制
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠18只，體重（150±10）g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。正常喂養(yǎng)1周后隨即分為正常對(duì)照組6只，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組12只，以高脂飲食喂養(yǎng)（標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上加2％膽固醇、10％豬油和5％玉米油）

10、。于第16周末從模型組大鼠中隨機(jī)隨機(jī)分出6只大鼠為辛伐他汀干預(yù)組，在高脂飲食基礎(chǔ)上加用辛伐他汀(4mg·kg-1·d-1)灌胃，余大鼠采用生理鹽水灌胃，均于第24周末隔夜空腹處死，留取血清及肝組織標(biāo)本。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST、TC、TG水平；ELISA法檢測(cè)血清脂聯(lián)素水平；HE染色、蘇丹Ⅳ染色和Masson三重染色分別觀察肝組織炎癥、脂肪變性及纖維化程度；RT-PCR法和Western Blot法測(cè)定肝組織脂聯(lián)素、e

11、NOS、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)的變化。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：LX-2細(xì)胞的準(zhǔn)備同第二部分。LX-2細(xì)胞的對(duì)照組加入溶劑，處理組分別加入TGF-β1(100pM)、辛伐他汀(10μM)、TGF-β1(100pM)+辛伐他?。?0μM）、L-NAME（100μM）、L-NAME（100μM）+辛伐他汀（10μM）處理24h，收取細(xì)胞。另準(zhǔn)備LX-2細(xì)胞做如下實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組加入溶劑，處理組加入不同濃度辛伐他?。?μM，2.5μM，5μM

12、，10μM）處理24h后收取細(xì)胞；或加入10μM辛伐他汀作用不同的時(shí)間(1h，1.5h，3h，6h，12h，24h)，觀察辛伐他汀對(duì)LX-2細(xì)胞中脂聯(lián)素表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、脂聯(lián)素在非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠肝臟中的表達(dá)及意義
　　 1.1模型大鼠血清生化指標(biāo)和脂聯(lián)素的變化：隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平逐漸升高，脂聯(lián)素水平逐漸降低，與對(duì)照組相比P＜0.05或P＜0

13、.01，并且血清ALT、AST、TC、TG水平與脂聯(lián)素水平負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.58、-0.52、-0.55和-0.45，P值均＜0.01。
　　 1.2肝組織病理學(xué)改變：模型組大鼠肝組織鏡下表現(xiàn)為肝細(xì)胞濁腫、氣球樣變，伴小葉內(nèi)混合性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、可見(jiàn)點(diǎn)、灶狀壞死，腫脹的肝細(xì)胞出現(xiàn)中、重度脂肪變性，以中央靜脈周圍最為明顯。隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝細(xì)胞脂肪變性及小葉內(nèi)炎癥逐漸加重。第16周末，部分模型大鼠肝組織出現(xiàn)少量竇周纖維化，

14、至24周末模型組大鼠均出現(xiàn)明顯竇周纖維化，部分可見(jiàn)中央靜脈周圍和匯管區(qū)纖維化。
　　 1.3大鼠肝組織脂聯(lián)素、AMPK和Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達(dá)變化：隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織脂聯(lián)素和AMPK的mRNA、蛋白表達(dá)逐漸減少，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增加，與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01。肝組織脂聯(lián)素和AMPKmRNA表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.81，P值＜0.01；二者均與Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別

15、為-0.88和-0.87，P值均＜0.01。以p-AMPK/AMPK表示其活性，則AMPK活性降低。肝組織脂聯(lián)素蛋白表達(dá)和AMPK活性呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.90，P值＜0.01；二者均與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.91和-0.94，P值均＜0.01。
　　 2、脂聯(lián)素抑制肝星狀細(xì)胞活化的分子機(jī)制
　　 2.1 TGF-β1誘導(dǎo)靜止型LX-2細(xì)胞表達(dá)α-SMA、Ⅰ型膠原，減弱AMPK活性，減少eNOS表

16、達(dá)，增加iNOS表達(dá)：經(jīng)ADM處理3天后，LX-2細(xì)胞僅表達(dá)少量α-SMA和Ⅰ型膠原，基本分化為靜止表型。用TGF-β1處理靜止型LX-2細(xì)胞，結(jié)果LX-2細(xì)胞活化并合成大量α-SMA和Ⅰ型膠原，α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)均增加（0.55±0.05vs.0.12±0.02：0.58±0.07vs.0.13±0.03，P值均＜0.05）、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)均增加(0.46±0.10vs.0.09±0.02;0.43±0.07vs

17、.0.08±0.03，P值均＜0.05);p-AMPK表達(dá)減少，AMPK活性減弱（用p-AMPK/AMPK表示：0.24±0.04vs.0.43±0.07，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白表達(dá)減少（0.30±0.10vs.0.44±0.08;0.30±0.09vs.0.46±0.07，P值均＜0.05），iNOSmRNA和蛋白表達(dá)增加（0.53±0.07vs.0.37±0.04;0.55±0.07vs.0.39±0.05，P值均＜

18、0.05）。
　　 2.2脂聯(lián)素抑制靜止型LX-2細(xì)胞活化，增強(qiáng)LX-2細(xì)胞中AMPK的活性，增加eNOS表達(dá)，減少iNOS表達(dá)：用脂聯(lián)素處理靜止型LX-2細(xì)胞，結(jié)果α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，AMPK活性增強(qiáng)（0.53工0.06vs.0.43±0.07，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白的表達(dá)增加(0.56±0.10vs.0.44±0.08;0.55±0.05vs.0.46±0.07,P值均＜0.05

19、)，iNOSmRNA和蛋白的表達(dá)減少（0.30±0.02vs.0.37±0.04;0.32±0.03vs.0.39±0.05，P值均＜0.05）。
　　 2.3脂聯(lián)素抑制由TGF-β1導(dǎo)致的α-SMA、Ⅰ型膠原高表達(dá)，增強(qiáng)AMPK活性，上調(diào)eNOS表達(dá)，下調(diào)iNOS表達(dá)：用脂聯(lián)素干預(yù)經(jīng)TGF-β1預(yù)處理的LX-2細(xì)胞，與TGF-β1組相比，α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)下降（0.32±0.08vs.0.55±0.05;0.32±0

20、.04vs.0.58±0.07,P值均＜0.05）、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)下降（0.29±0.05vs.0.46±0.10;0.32±0.04vs.0.43±0.07，P值均＜0.05），AMPK活性增強(qiáng)（0.43±0.07vs.0.24±0.04，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白的表達(dá)增加（0.43±0.08vs.0.30±0.10;0.42±0.07vs.0.30±0.09，P值均＜0.05），iNOSmRNA和蛋白的表達(dá)

21、減少（0.44±0.05vs.0.53±0.07;0.46±0.07vs.0.55±0.07，P值均＜0.05）。
　　 2.4脂聯(lián)素上調(diào)由L-NAME導(dǎo)致的eNOS低表達(dá)，抑制α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)：用L-NAME處理靜止型LX-2細(xì)胞，并以TGF-β1作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果二者均能導(dǎo)致LX-2細(xì)胞高表達(dá)α-SMA和Ⅰ型膠原、低表達(dá)eNOS。與對(duì)照組相比，L-NAME組的α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)均增加（0.41±0.04vs

22、.0.12±0.02;0.40±0.07vs.0.13±0.03,P＜0.05），Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)均增加（0.38±0.06vs.0.09±0.02;0.38±0.05vs.0.08±0.03，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白表達(dá)均減少（0.19±0.05vs.0.44±0.08;0.17±0.04vs.0.46±0.07，P值均＜0.05），iNOSmRNA和蛋白表達(dá)亦減少（0.22±0.05vs.0.37±0.04;

23、0.25±0.04vs.0.39±0.05，P值均＜0.05），AMPK活性無(wú)差異。脂聯(lián)素能上調(diào)由L-NAME導(dǎo)致的eNOS低表達(dá)，與L-NAME組比較，脂聯(lián)素+L-NAME組eNOS蛋白表達(dá)增加（0.31±0.05vs.0.17±0.04，P＜0.05），eNOSmRNA表達(dá)也增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脂聯(lián)素對(duì)L-NAME導(dǎo)致的iNOS低表達(dá)無(wú)影響，維持其低水平。
　　 3、辛伐他汀對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化的治療作用及其機(jī)制

24、>　　 3.1模型大鼠血清生化指標(biāo)和脂聯(lián)素的變化：隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平逐漸升高，脂聯(lián)素水平逐漸降低，與對(duì)照組相比P＜0.05或P＜0.01。與模型24周組相比，辛伐他汀治療組大鼠血清ALT、AST、TC、TG降低(P＜0.05或P＜0.01)，脂聯(lián)素水平雖有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.2肝組織病理學(xué)改變：隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝細(xì)胞脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥及纖維化程度逐漸加重。造模第24

25、周末，模型組大鼠肝組織均出現(xiàn)明顯竇周纖維化，部分可見(jiàn)中央靜脈周圍和匯管區(qū)纖維化。辛伐他汀干預(yù)組大鼠肝組織脂肪變性、炎癥及纖維程度均較模型24周組減輕。
　　 3.3大鼠肝組織脂聯(lián)素、eNOS、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達(dá)變化：隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型組大鼠肝組織脂聯(lián)素、eNOSmRNA和蛋白表達(dá)逐漸減少，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增加，與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01。與模型24周組相比，辛伐他汀組大鼠肝組織脂聯(lián)素mR

26、NA和蛋白的表達(dá)均增加(0.34±0.04vs.0.27±0.05;0.36±0.05vs.0.24±0.06，P＜0.05)，eNOSmRNA和蛋白的表達(dá)均增加(0.30±0.02vs.0.24±0.01;0.45±0.04vs.0.22±0.02，P＜0.05)，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)均減少（0.14±0.01vs.0.25±0.01;0.54±0.02vs.0.89±0.03，P＜0.05）。模型組大鼠肝組織中eNOSmRNA

27、和蛋白表達(dá)與Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.91、-0.92、-0.92和-0.89，P值均＜0.01。
　　 3.4辛伐他汀抑制靜止型LX-2細(xì)胞活化，上調(diào)eNOS表達(dá)：用辛伐他汀處理靜止型LX-2細(xì)胞，與對(duì)照組相比，α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，eNOSmRNA和蛋白的表達(dá)均增加(0.52±0.03vs.0.41±0.02：0.52±0.02vs.0.45±0.03,P＜0.05)。

28、>　　 3.5辛伐他汀抑制由L-NAME導(dǎo)致的eNOS低表達(dá)，抑制α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)：用辛伐他汀干預(yù)經(jīng)L-NAME預(yù)處理的LX-2細(xì)胞，與L-NAME組相比，α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)均下降（0.28±0.02vs.0.34±0.02;0.26±0.02vs.0.36±0.02，P＜0.05），Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)均下降（0.30±0.02vs．0.40±0.03;0.26±0.02vs.0.31±0.02，P＜0.05

29、），eNOSmRNA和蛋白的表達(dá)均增加(0.25±0.02vs.0.12±0.02;0.23±0.03vs.0.12±0.02,P＜0.05)。
　　 3.6辛伐他汀上調(diào)靜止型HSC中脂聯(lián)素的表達(dá)：用辛伐他汀處理靜止型LX-2細(xì)胞，與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素mRNA和蛋白表達(dá)增加，且呈時(shí)間和劑量依賴式遞增。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用高脂飲食可以成功復(fù)制非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠模型。
　　 2、脂聯(lián)素與AM