扶正化瘀復(fù)方調(diào)控IκB激酶-β對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化作用的研究.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)、非酒精性脂肪性肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌。非酒精性脂肪性肝纖維化是NASH相關(guān)肝硬化發(fā)生的必經(jīng)階段，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，亦缺乏特異治療方法，因此尋求一種有效的藥物阻止乃至逆轉(zhuǎn)非酒精性脂肪性肝纖維化成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

2、扶正化瘀復(fù)方是在肝纖維化的基本病機(jī)“正虛血瘀”基礎(chǔ)上研制成的傳統(tǒng)中藥復(fù)方，由丹參、絞股藍(lán)、桃仁、松花粉、蟲(chóng)草菌絲、五味子六味中草藥組方。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀復(fù)方(FuzhengHuayurecipe，F(xiàn)ZHY)可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)通路相關(guān)基因的異常表達(dá)阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展。IκB激酶-β(inhibitorκBkinase-β，IKK

3、-β)作為核因子-κB(NuclearFactor-κB，NF-κB)上游始動(dòng)信號(hào)，可促進(jìn)多種轉(zhuǎn)位相關(guān)基因的表達(dá)，目前尚缺乏IKK-β在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及靶向調(diào)控治療機(jī)制的研究。本研究采用高脂、膽堿-蛋氨酸缺乏(methionineandcholinedeficient，MCD)飲食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型，扶正化瘀復(fù)方或聯(lián)合血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)激動(dòng)劑血晶素(hem

4、in)進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察肝組織IKK-β及其調(diào)控的效應(yīng)因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)mRNA和蛋白的表達(dá)變化及對(duì)疾病進(jìn)展的影響，明確IKK-β在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病中的作用，進(jìn)一步闡明F

5、ZHY阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的機(jī)制，為臨床有效治療NAFLD提供理論依據(jù)。
　　 方法:采用MCD飼料喂養(yǎng)健康雄性C57BL/6J小鼠8周建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，分別給予扶正化瘀復(fù)方、血晶素或扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合血晶素進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以膽堿-蛋氨酸充足飼料設(shè)立對(duì)照組。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物毛發(fā)、活動(dòng)情況及體重變化;肝組織切片采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝組織脂肪變、炎癥活動(dòng);Masson染色觀

6、察肝臟纖維化程度;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)檢測(cè)IKK-β、MCP-1、MMP-2及CTGFmRNA的表達(dá)情況;Westernblot和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)IKK-β、MCP-1、MMP-2及CTGF蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況:對(duì)照組小鼠毛發(fā)有光澤，活潑好動(dòng)，體重隨造模時(shí)間逐漸增加;模型組

7、毛發(fā)紊亂、無(wú)光澤，活動(dòng)少，精神萎靡，體重明顯減輕;扶正化瘀復(fù)方組、血晶素組及扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合血晶素組小鼠毛發(fā)略顯紊亂，較黯淡，精神較為呆滯，活動(dòng)較少，攝食少、體重減輕。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟解剖及病理學(xué)變化:肉眼觀察:對(duì)照組小鼠肝臟為暗紅色，明亮有光澤，質(zhì)地柔軟有彈性。模型組小鼠肝臟體積明顯減小，與周?chē)M織有粘連，邊緣銳利，顏色淺黃，無(wú)光澤，切面油膩，質(zhì)地較硬，彈性差。扶正化瘀復(fù)方組、血晶素組及扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合血晶素組小鼠肝臟

8、體積亦減小，呈紅褐色，有光澤。光鏡下觀察:對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列成肝索，圍繞中央靜脈呈放射狀分布;模型組小鼠多數(shù)肝細(xì)胞呈現(xiàn)大泡性脂肪變，以腺泡3帶為著，小葉內(nèi)可見(jiàn)以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有點(diǎn)、灶狀肝細(xì)胞壞死，肝竇間隙變窄，可見(jiàn)竇周纖維化及匯管區(qū)纖維組織增生(NAS評(píng)分7～8S3～4);扶正化瘀復(fù)方組、血晶素組肝細(xì)胞脂肪變、炎癥及纖維化程度較模型組均明顯減輕(NAS評(píng)分5～6S1～2)，

9、尤以扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合血晶素組改善最顯著(NAS評(píng)分4～5S0～1)。
　　 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織IKK-β、MCP-1、MMP-2、CTGFmRNA和蛋白表達(dá):模型組IKK-βmRNA和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，應(yīng)用扶正化瘀復(fù)方、血晶素或扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合血晶素干預(yù)后，小鼠肝組織IKK-βmRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，伴隨炎癥因子MCP-1和促纖維化因子MMP-2、CTGF的表達(dá)下調(diào)，尤以扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合血晶素組下降最明顯。