扶正化瘀方抑制血管生成相關(guān)基因?qū)Ψ蔷凭灾拘愿卫w維化防治作用的研究.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確損肝因素所致的以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合癥，包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌。非酒精性脂肪性肝纖維化是該病進(jìn)展為肝硬化的重要階段，但其發(fā)病機制尚未明確，亦缺乏特效療法。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方可抑制肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，

2、阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的進(jìn)展。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞活化與肝微循環(huán)障礙及新生血管增長有關(guān)，但血管生成相關(guān)基因在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究應(yīng)用高脂、蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine and choline deficient，MCD)飲食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型，扶正化瘀方及血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）激動劑血晶素(Hemin)進(jìn)行干預(yù)，觀察α-平滑肌肌動

3、蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及其下游血管生成相關(guān)基因血管內(nèi)皮生成因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase，iNOs)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(macrophageinflammatory protein-

4、1α，MIP-1α)mRNA和蛋白的表達(dá)變化，探明血管生成相關(guān)基因在非酒精性脂肪性肝纖維化進(jìn)展中的作用及扶正化瘀方和/HO-1激動劑阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的主要機制，為臨床治療非酒精性脂肪性肝纖維化提供理論依據(jù)。
　　方法:選用清潔級7～8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠30只，隨機分為5組，每組6只，分別為對照組、模型組、扶正化瘀方組、血晶素組、扶正化瘀聯(lián)合血晶素組。采用MCD飲食建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，分別應(yīng)用扶正

5、化瘀方、血晶素、扶正化瘀方聯(lián)合血晶素進(jìn)行干預(yù)，以膽堿-蛋氨酸充足飼料設(shè)立對照組。觀察實驗小鼠精神及活動情況、毛發(fā)及體重變化;8周末處死動物，留取部分肝組織，4％甲醛溶液固定，石蠟包埋，備做病理切片，其5μm切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察肝臟脂肪變、炎癥程度、Masson三色染色觀察肝組織纖維化程度;余肝組織以液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，分別提取蛋白和RNA，采用實時熒光定量PCR(Real-t

6、ime quantitative Polymerase Chain Reaction，RealTime PCR)檢測α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs和MIP-1α mRNA的表達(dá)情況;Western blot和免疫組織化學(xué)染色法檢測α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs和MIP-1α蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用Quantity one分析系統(tǒng)軟件對Westernblot結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以HIF-1α/β-actin、V

7、EGF/β-actin、iNOs/β-actin積分光密度比值表示。肝組織mRNA及蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，各組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗， P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。并對比分析上述基因表達(dá)與肝組織病理學(xué)變化的關(guān)系，明確不同基因表達(dá)水平與肝纖維化進(jìn)展的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、實驗動物一般情況:對照組

8、小鼠活潑，好動;毛發(fā)有光澤，體重隨造模時間逐漸增加;模型組精神萎靡，少動，毛發(fā)無光澤，體重明顯減輕;應(yīng)用扶正化瘀方及血晶素組小鼠精神稍差，活動較少，毛發(fā)光澤較差，體重減輕，但較模型組明顯好轉(zhuǎn)，尤以扶正化瘀方聯(lián)合血晶素組小鼠較模型組改善明顯。
　　2、肝組織病理學(xué)變化:對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)均正常，肝索排列整齊，以中央靜脈呈放射狀分布;模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞呈現(xiàn)大泡性為主脂肪變性，小葉內(nèi)可見點、灶狀肝細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤、竇

9、周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成(NAS評分為5～6，肝纖維化評分為2～3);應(yīng)用扶正化瘀方或血晶素組肝細(xì)胞脂肪變、炎癥及纖維化較模型組明顯改善（NAS評分為2～4，肝纖維化評分為1～2）;血晶素聯(lián)合扶正化瘀方組肝損傷進(jìn)一步減輕(NAS評分為1～3，肝纖維化評分為0～1)。
　　3、肝組織α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs和MIP-1αmRNA表達(dá):模型組小鼠肝組織α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs和

10、MIP-1α mRNA表達(dá)較對照組均顯著上調(diào)，依次為8.33±2.32 vs1.01±0.19，4.50±0.78 vs1.03±0.28,7.40±1.54 vs0.92±0.20,9.94±1.60 vs0.93±0.20,7.65±1.87 vs1.01±0.11，P＜0.001;與模型組相比，應(yīng)用扶正化瘀方組肝組織α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs和MIP-1α mRNA表達(dá)明顯降低，依次為3.83±0.53，3.02

11、±0.55，3.23±0.94，3.60±0.96，3.70±1.14，P＜0.01;應(yīng)用血晶素組上述基因mRNA表達(dá)亦較模型組明顯降低，依次為3.94±0.83，2.29±0.78，3.17±1.06，2.81±0.41，4.16±1.31，P＜0.001;扶正化瘀方聯(lián)合血晶素組上述基因mRNA表達(dá)進(jìn)一步下降，依次為2.33±0.76，1.61±0.20，1.58±0.23，2.09±0.62,2.07±0.10。
　　4、肝組

12、織α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs和MIP-1α蛋白表達(dá):模型組小鼠肝組織α-SMA陽性面積百分比較對照組顯著增加，為(1.08±0.20)％VS（0.29±0.07）％，P＜0.001;與模型組相比，應(yīng)用扶正化瘀方或血晶素組肝組織α-SMA陽性面積百分比明顯下降，分別為（0.53±0.04）％、（0.49±0.11）％，P＜0.001;扶正化瘀方聯(lián)合血晶素組α-SMA陽性面積百分比進(jìn)一步下降為(0.29±0.07）％;模型

13、組小鼠肝組織HIF-1α、VEGF、iNOs蛋白表達(dá)較對照組均顯著增強，依次為0.55±0.08 vs0.24±0.07，1.08±0.034 vs0.36±0.05，3.30±0.88 vs1.08±0.09，P＜0.001;應(yīng)用扶正化瘀方組肝組織HIF-1α、VEGF和iNOs蛋白表達(dá)明顯降低，依次為0.44±0.02，0.54±0.07，1.61±0.21，P＜0.05;應(yīng)用血晶素組上述基因蛋白表達(dá)水平亦較模型組明顯降低，依次為0

14、.36±0.11，0.46±0.05，2.31±0.39， P＜0.01;扶正化瘀方聯(lián)合血晶素組上述基因蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步下降，依次為0.28±0.02，0.31±0.06，1.26±0.38;模型組小鼠肝組織MIP-1α陽性面積百分比較對照組顯著增加，為（0.71±0.09）％vs（0.11±0.03）％，P＜0.001;與模型組相比，應(yīng)用扶正化瘀方或血晶素組肝組織MIP-1α陽性面積百分比明顯降低，分別為（0.41±0.07）％、（

15、0.43±0.11）％，P＜0.001;扶正化瘀方聯(lián)合血晶素組上述基因蛋白陽性面積百分比為（0.25±0.07）％，較單用扶正化瘀方及血晶素組進(jìn)一步降低。
　　結(jié)論:
　　1、α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs及MIP-1α在MCD飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　2、扶正化瘀方通過抑制肝星狀細(xì)胞活化，下調(diào)HIF-1α及其下游VEGF、iNOs等血管生成相關(guān)基因表達(dá)阻止非酒精性脂肪