扶正化瘀復(fù)方對非酒精性脂肪性肝纖維化防治作用的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)為與肥胖、糖尿病等疾病密切相關(guān)的一大慢性肝病，其在發(fā)達國家的發(fā)病率可達20%，近年在國內(nèi)也大幅增長，發(fā)病年齡趨于低齡化，病情可進一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，嚴重威脅著人類健康。纖維化為機體對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是一種可逆性改變。因此，尋找一種有效的抗纖維化治療措施，將會對臨床治療NAFLD具有重要意義。
　　扶正化瘀復(fù)方為針

2、對慢性肝炎肝纖維化、肝硬化的“瘀血內(nèi)結(jié)、正氣虛弱”病機，在反復(fù)藥理實驗研究基礎(chǔ)上配伍組方研制的具有抗纖維化作用的傳統(tǒng)中藥復(fù)方，由桃仁、丹參、絞股藍、蟲草菌絲、松花粉、五味子六味中草藥組成，可以顯著改善慢性乙型病毒性肝炎或肝炎后肝硬化患者的臨床癥狀與肝功能，逆轉(zhuǎn)肝纖維化，降低門靜脈壓力，但其對非酒精性脂肪性肝纖維化是否具有保護作用及作用機制尚未見報道。
　　本課題采用高脂、膽堿-蛋氨酸缺乏(high fat，methionine-c

3、holinedeficient diet，MCD)飲食建立非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型，觀察扶正化瘀復(fù)方對非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠的抗纖維化作用并探討其作用機制，為非酒精性脂肪性肝纖維化的臨床治療及傳統(tǒng)中藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　第一部分扶正化瘀復(fù)方對MCD飲食小鼠一般情況、血清生化學(xué)及肝組織病理學(xué)的影響
　　目的：探明扶正化瘀復(fù)方對MCD飲食所誘導(dǎo)肝纖維化的預(yù)防及治療作用，明確扶正化瘀復(fù)方與血紅素氧合酶-1(heme

4、 oxygenase-1，HO-1)激動劑聯(lián)合是否具有協(xié)同拮抗非酒精性脂肪性肝纖維化的作用，為非酒精性脂肪性肝纖維化的防治奠定基礎(chǔ)。
　　方法：采用MCD飲食喂養(yǎng)健康雄性C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，同時應(yīng)用扶正化瘀復(fù)方或聯(lián)合應(yīng)用HO-1激動劑血晶素進行干預(yù)實驗，以膽堿-蛋氨酸充足飲食設(shè)為對照組。酶法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移

5、酶(aspartate aminotransferase，AST)水平；HE和Masson染色觀察肝脂肪變、炎癥活動和纖維化程度，并依照2010年中華醫(yī)學(xué)會脂肪肝學(xué)組《非酒精性脂肪性肝病診療指南》及美國NASH臨床研究協(xié)會病理工作組2005年制定的NAFLD組織學(xué)評分(NAFLD activity score，NAS)系統(tǒng)對肝脂肪變、炎癥及纖維化程度進行評估。
　　結(jié)果：
　　1實驗小鼠行為學(xué)改變
　　各組實驗小鼠均無

6、死亡，與對照組相比，模型組小鼠毛發(fā)紊亂、無光澤，體重明顯減輕，活動減弱、少動，精神萎靡。與模型組相比，扶正化瘀復(fù)方組及扶正化瘀復(fù)方與HO-1激動劑聯(lián)合應(yīng)用組小鼠一般狀態(tài)尚可，毛發(fā)略顯紊亂，較黯淡，攝食減少、體重減輕，活動較少，精神較為呆滯。
　　2實驗小鼠肝臟解剖學(xué)及組織病理學(xué)改變
　　2.1大體觀察
　　對照組小鼠肝臟為暗紅色，被膜光滑，明亮有光澤，質(zhì)地柔軟有彈性。模型組小鼠肉眼觀可見肝臟體積明顯減小，邊緣圓鈍，顏色

7、變黃，無光澤，有明顯油膩感，且與周圍組織有粘連，質(zhì)地較硬，彈性差。血晶素組與扶正化瘀復(fù)方組小鼠無明顯差別，毛發(fā)略顯紊亂，較黯淡，攝食減少、體重減輕，活動減弱，精神呆滯；扶正化瘀復(fù)方與血晶素聯(lián)合組小鼠毛發(fā)較整齊、略有光澤，攝食較少，體重稍有下降，活動尚可，反應(yīng)較靈敏，精神較飽滿。
　　2.2光鏡下觀察
　　對照組小鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)均基本正常，肝板走行整齊，肝細胞索排列整齊清晰，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細胞形狀規(guī)則，排列

8、致密、較均一，細胞核呈圓形；模型組小鼠呈非酒精性脂肪性肝纖維化表現(xiàn)，肝細胞呈大泡性脂肪變，小葉內(nèi)可見灶狀肝細胞壞死，伴有淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，肝竇間隙變窄，竇周細胞增生活躍，匯管區(qū)擴大，纖維組織增生，可見纖維間隔形成，NAS評分7～8S2～3；與模型組比較，血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組、扶正化瘀復(fù)方與血晶素聯(lián)合組小鼠肝臟損傷明顯減輕，肝細胞呈輕度水樣變，可見少數(shù)肝細胞呈脂肪變，個別呈氣球樣變，未見明顯的肝細胞壞死及炎細胞浸潤，偶見輕度纖

9、維組織增生，匯管區(qū)擴大不明顯(NAS評分5-6S1～2)，尤以血晶素聯(lián)合扶正化瘀復(fù)方組病變?yōu)檩p(NAS評分1～2SO-1)。
　　3實驗小鼠血清ALT、AST水平
　　對照組小鼠血清ALT、AST水平分別為：30.60±5.86U/L和32.00±5.57U/L，模型組小鼠血清ALT、AST水平分別為222.00±6.96U/L和316.00±14.2U/L，顯著高于對照組(P<0.001；P<0.001)；血晶素組血清AL

10、T、AST分別為146.80±9.20U/L和134.00±11.03U/L；扶正化瘀復(fù)方組血清ALT和AST分別為106.20±8.44U/L和108.60±10.48U/L，兩組血清轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著低于模型組(P<0.01；P<0.01)；扶正化瘀復(fù)方與血晶素聯(lián)合應(yīng)用組血清ALT、AST分別為71.25±12.76 U/L和55.25±8.50U/L，與扶正化瘀復(fù)方組(P<0.001；P<0.001)、血晶素組(P<0.01；P<0

11、.01)小鼠相比均顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1扶正化瘀復(fù)方可以顯著改善MCD飲食小鼠一般情況，降低血清ALT、AST水平，減輕肝脂肪變、炎癥及肝纖維化；
　　2扶正化瘀復(fù)方與血晶素具有協(xié)同拮抗非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病及進展的作用。
　　第二部分扶正化瘀復(fù)方對非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化與炎癥相關(guān)因子表達的影響
　　目的：觀察扶正化瘀復(fù)方對MCD飲食小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化與炎癥相關(guān)因子表達的影響，

12、初步探討扶正化瘀復(fù)方拮抗非酒精性脂肪性肝炎及肝纖維化的機制。
　　方法：采用MCD飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型，分別應(yīng)用扶正化瘀復(fù)方、HO-1激動劑血晶素(hemin)進行干預(yù)實驗，以膽堿-蛋氨酸充足飲食設(shè)為對照組。采用硫代巴比妥酸法測定肝臟組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；采用實時定量PCR和Western blot方法檢測脂質(zhì)過氧化相關(guān)基因(HO-1)、氧化應(yīng)激相

13、關(guān)基因(CYP2E1)的表達；采用實時定量PCR方法檢測炎癥相關(guān)因子(TNF-α，IL-6)mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　1實驗小鼠肝組織中MDA含量的改變
　　對照組小鼠肝臟組織MDA含量為1.72±0.42nmol/mg，MCD模型組小鼠為5.67±1.25nmol/mg，明顯高于對照組(P<0.001)；與模型組比較，血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組小鼠肝臟組織MDA含量均明顯降低，分別為3.58±0.71nmol/

14、mg與3.88±0.79nmol/mg(P<0.05；P<0.05)，而扶正化瘀復(fù)方與血晶素聯(lián)合應(yīng)用組MDA含量為3.17±0.77nmol/mg，分別與扶正化瘀復(fù)方組(P<0.01)、血晶素組(P<0.05)小鼠相比顯著降低。
　　2扶正化瘀復(fù)方對實驗小鼠肝組織中CYP2E1表達的影響
　　實時定量PCR和Western blot方法檢測結(jié)果一致，MCD模型組小鼠肝組織CYP2E1 mRNA及蛋白表達水平與對照組比較明顯升

15、高；與模型組相比，血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組小鼠肝組織CYP2E1表達水平均顯著下降；而血晶素與扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合應(yīng)用組分別與扶正化瘀復(fù)方組、血晶素組小鼠相比CYP2E1表達水平亦顯著下降。
　　3扶正化瘀復(fù)方對實驗小鼠肝組織中HO-1表達的影響
　　與對照組比較，MCD模型組小鼠肝組織HO-1 mRNA及蛋白表達水平明顯升高；血晶素組小鼠肝組織HO-1表達水平與模型組相比顯著升高；而扶正化瘀復(fù)方組小鼠肝組織HO-1表達水平較模

16、型組顯著下降，扶正化瘀復(fù)方與血晶素聯(lián)合應(yīng)用組小鼠肝組織HO-1表達水平高于扶正化瘀復(fù)方組，低于血晶素組。
　　4扶正化瘀復(fù)方對實驗小鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平的影響
　　MCD模型組小鼠肝組織TNF-α與IL-6 mRNA表達水平與對照組比較明顯增高；與模型組比較，血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組小鼠肝組織TNF-α、IL-6 mRNA表達水平均顯著下降；而血晶素與扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合應(yīng)用組分別與扶正化瘀復(fù)方

17、組、血晶素組小鼠相比TNF-α、IL-6 mRNA表達亦顯著下降，提示血晶素、扶正化瘀復(fù)方均可從mRNA水平抑制TNF-α與IL-6的表達，減輕MCD飲食誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，尤其兩者聯(lián)合應(yīng)用其作用更為顯著。
　　結(jié)論：
　　1在MCD飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠模型中，存在脂質(zhì)過氧化與氧化應(yīng)激反應(yīng)，此可能為非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病的重要致病機制之一；
　　2扶正化瘀復(fù)方可以下調(diào)CYP2E1、HO-1基因的表達，阻

18、止或減輕脂質(zhì)過氧化與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝損傷；
　　3扶正化瘀復(fù)方可以抑制炎癥相關(guān)因子TNF-α與IL-6的表達，進一步阻止非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生與進展；
　　4扶正化瘀復(fù)方與血晶素具有協(xié)同拮抗MCD飲食誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化、氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝及炎癥因子表達的作用，進一步減輕或阻止肝臟炎癥向肝纖維化的進展。
　　第三部分扶正化瘀復(fù)方對非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠纖維化相關(guān)因子表達的影響
　　目的：探明扶正

19、化瘀復(fù)方阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的主要作用靶點和分子生物學(xué)機制。
　　方法：采用MCD飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，實驗分組及干預(yù)方式同第二部分。采用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscleactin，a-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)、Col-1

20、、Col-3 mRNA和蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1扶正化瘀復(fù)方對各組實驗小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1 mRNA與蛋白表達的影響
　　與對照組比較，MCD模型組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1 mRNA與蛋白表達水平明顯升高；與模型組比較，血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1 mRNA與蛋白表達水平顯著降低，而血晶素組與扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合應(yīng)用組分別與血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組比較，α-SMA

21、、TGF-β1 mRNA、蛋白表達水平亦顯著降低，證實扶正化瘀復(fù)方與血晶素均可以抑制α-SMA、TGF-β1 mRNA的表達，尤其扶正化瘀復(fù)方與血晶素聯(lián)合應(yīng)用其抑制作用更為顯著。
　　2扶正化瘀復(fù)方對實驗小鼠肝組織Col-1、Col-3 mRNA與蛋白表達的影響
　　與對照組比較，MCD模型組小鼠肝組織Col-1、Col-3 mRNA與蛋白表達水平顯著升高；與模型組比較，血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組小鼠肝組織Col-1和Col-

22、3 mRNA、蛋白表達水平顯著降低，而血晶素組與扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合應(yīng)用組分別與血晶素組、扶正化瘀復(fù)方組比較，Col-1、Col-3mRNA、蛋白表達水平亦顯著降低，證實扶正化瘀復(fù)方與血晶素均可以抑制Col-1、Col-3 mRNA與蛋白的表達，尤其扶正化瘀復(fù)方與血晶素聯(lián)合應(yīng)用其抑制作用更為顯著。
　　結(jié)論：
　　1扶正化瘀復(fù)方可顯著抑制促纖維化相關(guān)基因α-SMA、TGF-β1、Col-1、Col-3的表達，尤其以扶正化瘀復(fù)方與