RNAi沉默hTERT對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、端粒酶在惡性腫瘤、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，深入理解它們之間的關(guān)系，及端粒酶在這些病理過(guò)程中作用的具體機(jī)制，必將給腫瘤及心血管疾病的治療帶來(lái)巨大的變化。hTERT介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖是近年來(lái)端粒酶研究的熱點(diǎn)。 hTERT是端粒酶全酶的蛋白組分，在端粒延伸中以逆轉(zhuǎn)錄酶活性催化合成端粒重復(fù)序列，在正常組織不表達(dá)，在腫瘤組織及某些活躍增殖的細(xì)胞高表達(dá)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為端粒酶通過(guò)維持端粒的長(zhǎng)度而參與細(xì)胞衰老和永生化生物學(xué)過(guò)程的調(diào)

2、節(jié)，近年來(lái)的研究揭示，在正常細(xì)胞過(guò)表達(dá)hTERT能促使細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，這種作用與端粒延伸無(wú)關(guān)，甚至不需要端粒酶RNA亞基的參與，提出hTERT可能具有其它的非端粒延伸的功能。 通過(guò)近年來(lái)的研究，hTERT的促細(xì)胞增殖作用已經(jīng)明確，但其中的機(jī)制尚未闡明；另一方面，若在腫瘤細(xì)胞沉默該基因，是否會(huì)出現(xiàn)有利于腫瘤治療的效應(yīng)?本研究的目的在于探討hTERT的沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制。具體地說(shuō)，用RNAi技術(shù)沉默HeLa細(xì)胞hTE

3、RT的表達(dá)，以觀察在腫瘤細(xì)胞這種多個(gè)癌基因、抑癌基因突變，多條信號(hào)通路和代謝特征改變的背景下，單純下調(diào)hTERT的表達(dá)，能否使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯放慢，使腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，能否增加細(xì)胞對(duì)某些化療藥的敏感性，探討端粒酶催化亞單位hTERT促細(xì)胞增殖作用的機(jī)制，及是否適合作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。 第一部分 shRNA表達(dá)體的構(gòu)建和沉默細(xì)胞株的篩選方法： 1．以HeLa細(xì)胞提取的基因組DNA為模板經(jīng)PCR得到U6啟動(dòng)

4、子； 2．在質(zhì)粒pUC119的MCS內(nèi)插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子成為RNAi載體； 3．在RNAi載體U6啟動(dòng)子的下游插入干擾序列獲得shRNA-hTERT表達(dá)體； 4．將兩個(gè)shRNA-hTERT表達(dá)體和RNAi載體分別與pEGFP-C1共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，G418篩選。 結(jié)果： 1．測(cè)序顯示構(gòu)建RNAi載體和表達(dá)體正確； 2．篩選得到兩個(gè)hTERT沉默的HeLa細(xì)胞株和一個(gè)對(duì)照細(xì)胞株。 第

5、二部分 hTERT的沉默對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)及化療敏感性的影響方法： 1．RT-PCR和Western-Blot檢測(cè)hTERT和c-myc的表達(dá)水平； 2．細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)； 3．倒置顯微鏡下觀察長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、順鉑等化療藥對(duì)干擾組和對(duì)照組細(xì)胞的影響，流式測(cè)細(xì)胞死亡率； 4．細(xì)胞免疫化學(xué)顯示微管組織狀態(tài)在各組細(xì)胞有無(wú)差別。探討各組細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿和紫杉醇敏感性差別的原因，hTERT可能具有的新的功

6、能是否與微管組織的調(diào)節(jié)有關(guān)。 結(jié)果： 1．干擾的靶基因hTERT被完全沉默； 2． c-myc的表達(dá)在干擾組和對(duì)照組細(xì)胞無(wú)顯著差異； 3．篩選得到的第六代干擾組和對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異； 4．紫杉醇處理的干擾組細(xì)胞死亡率高于對(duì)照組； 5．干擾組和對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)紫杉醇處理后的微管分布沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了一個(gè)RNAi載體及兩個(gè)shRNA表達(dá)體。