RNAi沉默Survivin基因抑制人胰腺癌Patu 8988細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： Survivin是近年新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成員之一，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，在胰腺癌組織中高表達(dá)而在正常組織中不表達(dá)，其表達(dá)與胰腺癌的細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成密切相關(guān)。通過(guò)調(diào)低該基因的表達(dá)有助于抑制細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)腫瘤形成。RNA干擾(RNAi)能高效特異地調(diào)低基因表達(dá)，已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究。本課題通過(guò)構(gòu)建Survivin shRNA重組

2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌Patu8988細(xì)胞，體內(nèi)、外觀察shRNA表達(dá)載體對(duì)Patu8988細(xì)胞Survivin基因表達(dá)的影響，以及對(duì)Patu8988細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，探討Survivin基因在胰腺癌中的作用，為進(jìn)一步研究胰腺癌的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： ①軟件分析Survivin mRNA結(jié)構(gòu)以篩選出擬干擾靶位點(diǎn)，構(gòu)建Survivin shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-

3、Survivin-2和pGenesil-1-Survivin-1+2，同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照重組質(zhì)粒pGenesil-1-NC，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，提取各組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Patu8988細(xì)胞； ②實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pGenesil-1-Survivin-1組、pGenesil-1-Survivin-2組、pGenesil-1-Survivin-1+2組和pGenesil-1-NC組，分別進(jìn)行體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)； ③在48 h時(shí)檢測(cè)細(xì)

4、胞凋亡，RT-PCR和FCM測(cè)定Survivin mRNA和Survivin蛋白的相對(duì)含量，以觀察各重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Patu8988細(xì)胞后對(duì)Survivin基因表達(dá)的抑制作用； ④MTT測(cè)定細(xì)胞增殖能力，Western-blotting測(cè)定Survivin蛋白的表達(dá)； ⑤G418篩選獲得各重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Patu8988細(xì)胞，接種BALB/c裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通過(guò)觀測(cè)成瘤時(shí)間、瘤體積和瘤重量，免疫組化測(cè)定S

5、urvivin蛋白表達(dá)，透射電鏡觀察瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，研究Survivin shRNA對(duì)胰腺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。 結(jié)果： ①酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2和pGenesil-1-NC構(gòu)建成功； ②FCM測(cè)得各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分比均大于60％；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h，pGenesil-1-Surv

6、ivin-1、pGenesil-1-Survivin-2和pGenesil-1-Survivin-1+2對(duì)Patu8988細(xì)胞Survivin mRNA抑制率分別是空白對(duì)照組的65.62％、54.89％、64.96％，與空白對(duì)照組相比差異具有顯著性意義(p<0.05)； FCM檢測(cè)五組凋亡指數(shù)都很低，各組無(wú)差別； ③MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖速度的比較表明，pGenesil-1-Survivin-1組、pGenesil-1-Surv

7、ivin-1+2組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力明顯下降，pGenesil-1-Survivin-2組細(xì)胞的增殖能力有一定下降，但不如前兩者；FCM測(cè)得Survivin蛋白抑制率分別為64.61％、32.68％和59.49％(與對(duì)照組相比，p<0.05)，Western-blotting結(jié)果與FCM結(jié)果基本相符； ④pGenesil-1-Survivin-1組和pGenesil-1-Survivin-1+2組移植瘤的平均成瘤時(shí)間略有延遲，與

8、空白對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(p>0.05)， pGenesil-1-Survivin-1組、 pGenesil-1-Survivin-2組和pGenesil-1-Survivin-1+2組平均瘤體積、瘤重量明顯下降；切片的免疫組化結(jié)果顯示：瘤體組織大片狀壞死，影響蛋白的正常表達(dá)；透射電鏡顯示各組瘤細(xì)胞凋亡很少，與PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果一致； ⑤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：pGenesil-1-Survivin-1組對(duì)Patu8988細(xì)胞Surv

9、ivin的干擾作用最好，抑制瘤細(xì)胞的增殖也最明顯，略優(yōu)于pGenesil-1-Survivin-1+2組，pGenesil-1-Survivin-2組干擾作用最差，而pGenesil-1-NC對(duì)Patu8988細(xì)胞Survivin基因無(wú)明顯干擾作用，對(duì)瘤細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。 結(jié)論： 成功構(gòu)建Survivin shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGe