RNA干擾技術(shù)阻斷PTEN基因表達(dá)對(duì)SACC-83細(xì)胞系的影響.pdf

1、背景:涎腺腺樣囊性癌是涎腺上皮來(lái)源的惡性程度最高的腫瘤之一，其顯著生物學(xué)特征為早期浸潤(rùn)性，病患常常累及神經(jīng)，使患者因疼痛和神經(jīng)麻痹，導(dǎo)致相應(yīng)的功能障礙。手術(shù)切除是其首選的治療方法，根治性手術(shù)需要擴(kuò)大切除，術(shù)后的復(fù)發(fā)率居高不下，并且預(yù)后較差，給患者帶來(lái)巨大痛苦，因此亟需更好的手段治療。致使腫瘤發(fā)生的因素很多，其中抑癌基因?qū)τ谀[瘤發(fā)生發(fā)展的作用極為重要，并成為腫瘤靶向治療的重要候補(bǔ)靶點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)一些與腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抑癌基因以

2、及癌基因，比如:P53、c-erbB-2、Beclinl等。PTEN基因的全稱為人類第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphataseand tensin homologue deleted chromatosome ten，PTEN)，作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙重特異性磷酸酶作用的抑癌基因，近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注。大量的研究顯示，PTEN基因在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖及分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附能力、遷移和侵襲能力，及

3、其他腫瘤生物學(xué)行為起重要的調(diào)控作用，PTEN基因功能缺失可以影響多種組織來(lái)源腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，但是在涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中PTEN基因的作用尚少見文獻(xiàn)報(bào)道。SACC-83細(xì)胞系是1983年從一位26歲女性患者的舌下腺腺樣囊性癌的術(shù)后標(biāo)本中分離、培養(yǎng)并鑒定的，已被廣泛應(yīng)用在腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移研究中，例如在SACC-83細(xì)胞系中將C-ebB2基因利用RNA干擾技術(shù)將其表達(dá)下調(diào)可以發(fā)現(xiàn)SACC-83細(xì)胞的增殖受到了抑制，但PTE

4、N基因在SACC-83細(xì)胞系的表達(dá)與作用尚未見報(bào)道。
　　目的:下調(diào)涎腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞系中抑癌基因PTEN的表達(dá)，在體外觀察PTEN對(duì)SACC-83細(xì)胞系生物學(xué)行為的改變，研究PTEN基因?qū)ο严傧贅幽倚园┌l(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用。
　　方法:利用Lipofectamine2000試劑盒將干擾RNA轉(zhuǎn)染到SACC-83細(xì)胞系中建立PTEN下調(diào)的細(xì)胞;在蛋白水平上應(yīng)用Western Blot實(shí)驗(yàn)方法檢驗(yàn)下調(diào)PTEN基因是

5、否成功;利用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)研究PTEN基因下調(diào)后SACC-83細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)的情況;Brdu摻入實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步定位明確PTEN基因干擾下調(diào)后對(duì)SACC-83細(xì)胞增殖方面的影響;應(yīng)用Transwell和Matrigel建立體外人工基底膜侵襲模型，分析細(xì)胞的侵襲能力。另外應(yīng)用經(jīng)典的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell小室不加人工基底膜的方式，觀察SACC-83細(xì)胞的遷移能力。利用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞的黏附能力改變;應(yīng)用流式

6、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期的變化。數(shù)據(jù)結(jié)果利用SPSS17.0進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:1.Western Blot結(jié)果顯示，干擾RNA轉(zhuǎn)染可在蛋白水平上成功下調(diào)SACC-83細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。2.CCK8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)以及Brdu摻入實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析顯示，PTEN基因下調(diào)后SACC-83細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。3.Transwell加Matrigel膠實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞干擾后穿越小室的細(xì)胞數(shù)量增多，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)基底膜侵襲能力提高。應(yīng)用Tr

7、answell不加Matrigel膠建立的體外細(xì)胞運(yùn)動(dòng)模型和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，PTEN基因下調(diào)組細(xì)胞的遷移能力明顯下降。4.細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)顯示，PTEN基因下調(diào)組的黏附能力增強(qiáng)。5.流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTEN基因下調(diào)細(xì)胞在S期細(xì)胞數(shù)量比例增大;G1期的細(xì)胞比例減少。
　　結(jié)論:在體外培養(yǎng)的涎腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞中下調(diào)PTEN基因表達(dá)，可以顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和黏附能力，提示了抑癌基因PTEN可調(diào)控涎腺腺樣囊