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文檔簡介
1、目的:
探討人涎腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞在常氧和低氧環(huán)境中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)行為的變化,沉默HIF-1α對低氧環(huán)境中的SACC-83細(xì)胞生長、遷移和侵襲能力的影響及對血管生成的影響和機制。
方法:
1、shRNA-HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞,經(jīng)G418篩選和挑取陽性集落細(xì)胞擴增培養(yǎng),Western blot鑒定沉默效率。
2、Western blot、雙抗體
2、夾心ELISA法檢測SACC-83細(xì)胞在常氧(21%O2)和低氧(5%O2)環(huán)境中HIF-1α、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表達(dá)水平的差異及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌情況;沉默HIF-1α對低氧(5%O2)環(huán)境中SACC-83細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)及VEGF分泌的影響。
3、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外三維培養(yǎng)法分析常氧(21%O2)和低氧(5%O2)環(huán)境中培養(yǎng)的SACC-83細(xì)胞分泌物促血管形成能力的差
3、別以及沉默HIF-1α對低氧(5%O2)環(huán)境中SACC-83細(xì)胞分泌物促血管形成能力的影響。
4、細(xì)胞劃痕實驗、Transwell侵襲實驗觀察SACC-83細(xì)胞在常氧(21%O2)和低氧(5%O2)環(huán)境中的遷移、侵襲能力以及沉默HIF-1α對低氧(5%O2)環(huán)境中SACC-83細(xì)胞的遷移、侵襲能力的影響。
5、MTT比色法、流式細(xì)胞分析法檢測SACC-83細(xì)胞在常氧(21%O2)和低氧(5%O2)環(huán)境中增殖、凋亡和細(xì)
4、胞周期的變化情況以及沉默HIF-1α對低氧(5%O2)環(huán)境中SACC-83細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。
結(jié)果:
1、成功構(gòu)建HIF-1α低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株(SACC-83/shHIF-1α)。
2、Western blot和ELISA結(jié)果顯示,SACC-83細(xì)胞在低氧環(huán)境下HIF-1α、MMP-2蛋白表達(dá)水平及培養(yǎng)上清VEGF分泌明顯增加(P<0.01),促血管形成能力提高(P<0.05),細(xì)胞遷移(P
5、<0.01)和侵襲能力(P<0.05)更強,但細(xì)胞增殖、凋亡和周期分布的變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
3、在低氧環(huán)境中,SACC-83/shHIF-1α細(xì)胞MMP-2蛋白、培養(yǎng)上清中VEGF蛋白含量均降低(P<0.01),促血管形成能力明顯下降(P<0.01),細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著變?nèi)酰≒<0.01),凋亡細(xì)胞比例增高(P<0.05),但細(xì)胞周期分布無明顯差異(P>0.05)。
結(jié)論:
低氧
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