PPy-CS和FK506表面修飾對生物材料促成骨作用研究.pdf

1、第一部分PPy-CS涂層表面修飾對植入物界面促骨整合能力的影響
　　目的:評價PPy-CS涂層修飾植入物后在兔子體內生物相容性及促骨整合的能力。
　　方法:選擇17只雌性、體重在3.20±0.20 kg的新西蘭大白兔，將PPy-CS涂層修飾的可吸收釘及未經涂層修飾的兩種螺釘及臨床應用的不銹鋼釘植入新西蘭大白兔雙側的下肢中，每側下肢植入一種類型螺釘，脛骨上端植入2枚釘子，股骨髁部植入1枚釘子;其中12只實驗兔用作分別觀察12周

2、及26周，另外5只實驗兔用作觀察12周時的力學測試。通過觀察實驗兔術前術后的飲食、飲水、體重、體溫、術后的體征、血液生化檢測、安樂死后器官重量及病理檢測，釘子周緣的軟組織的大體觀及病理檢測，μ-CT檢測釘子周緣的成骨情況，以及釘子進行硬組織切片檢測，來明確該涂層的兼容性及在12w及26w時的在釘子周緣的促成骨能力。
　　結果:涂層組與未涂層組實驗兔均生長良好，2組在術前術后的飲食、飲水、體重、體溫、術后的體征、血液生化檢測、安樂死

3、后器官重量及病理檢測，釘子周緣的軟組織的大體觀及病理檢測，釘子的硬組織切片檢測等觀察結果進行統(tǒng)計后，均未見明顯的統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明該PPy-CS涂層應用于動物體內后，在12w及26w的觀察期限內，均未見系統(tǒng)及局部的毒副反應;經μ-CT、扭力測試、四環(huán)素熒光檢測及硬組織的甲苯胺藍染色后發(fā)現(xiàn)，涂層組較未涂層組的結果在12w及26w均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明PPy-CS涂層具有較好的促成骨能力。
　　結論:PPy

4、-CS涂層表面修飾的生物材料，在植入動物體內12w及26w時生物相容性良好，同時具有良好的促骨整合的能力。
　　第二部分FK506表面修飾對多孔支架成骨效能體外研究
　　目的:體外檢測緩釋不同濃度FK506的多孔PLA/β-TCP支架對間充質干細胞成骨誘導作用的研究。
　　方法:利用微米級β-TCP高能球磨法制備納米級β-TCP(Nβ-TCP)，將聚乳酸(PLA)與納米β-TCP顆?；旌现频忙?TCP質量百分比為30％

5、的混合溶液(70PLA/30β-TCP)，再稱取不同比例的FK506加入上述溶液中，混合均勻后注入特制的聚四佛乙烯模具，凍干后制備表面修飾了不同F(xiàn)K506質量百分比濃度的多孔支架材料，制成統(tǒng)一5mm×5mm×3mm大小。利用ELISA試劑盒檢測上述含不同F(xiàn)K506濃度的支架材料分別在0.33、0.66、1、2、6、12、24、48、96、144、336、720h時間點藥物緩釋情況，初步明確其藥物緩釋曲線。另取來自人的骨髓間充質干細胞(B

6、MSCs)以1×106/30μl接種于不同F(xiàn)K506濃度的多孔支架，體外共培養(yǎng)2周，其中培養(yǎng)1周時隨機取支架-細胞復合物在電鏡下觀察。在培養(yǎng)1周、2周時，分別取培養(yǎng)液進行OCN檢測，取出復合細胞的多孔支架經研磨、裂解后進行ALP檢測。
　　結果:成功獲得5種含F(xiàn)K506不同質量百分比(0％、2％、4％、6％、8％)的納米級PLA/β-TCP多孔支架。獲得了上述經FK506修飾的多孔支架的藥物緩釋曲線，6％組的FK506的釋放量較其

7、他各組均有增高。細胞-支架培養(yǎng)1周后電鏡觀察示BMSCs在多孔支架內生長良好。支架與細胞共培養(yǎng)1周時，5種不同濃度的多孔支架經裂解、研磨后，發(fā)現(xiàn)6％質量百分比的支架ALP值較其他各組高，但經統(tǒng)計學分析，5組間未見統(tǒng)計學意義;2周時，各組的ALP均值較前有增高，6％組與其他幾組均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而在支架與細胞共培養(yǎng)后1周時，對5種不同濃度的多孔支架的培養(yǎng)液進行OCN檢測，發(fā)現(xiàn)6％組OCN檢測值較其他各組均有增高（P＜0.05

8、）;而在2周時，6％組與8％組OCN值均較其他各組明顯增高，經統(tǒng)計學分析，6％組與8％組均較其他3組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但該兩組間未見明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:BMSCs可以在經FK506表面修飾的納米級多孔PLA/β-TCP內生長，6％組多孔支架有較好的藥物緩釋曲線，同時對該組在體外復合BMSCs后的ALP及OCN檢測，初步認為6％質量百分比的經FK506修飾的N-PLA/β-TCP在體外促成骨方面可

9、能有一定的優(yōu)勢。
　　第三部分FK506表面修飾對多孔支架材料在動物體內生物相容性及促成骨效能的影響
　　目的:探討經FK506修飾的N-PLA/β-TCP多孔支架在動物體內生物相容性及促成骨的作用，從而結合體外實驗明確最佳的FK506修飾濃度。
　　方法:將不同質量百分比FK506分別修飾的N-PLA/β-TCP多孔支架制作成5mm×5mm×3mm大小，輻射消毒后備用。用DiI及Brdu標記人BMSCs，以1×106

10、/30μl接種于上述5種支架材料中。在共培養(yǎng)2周時，將接種細胞多孔支架材料植入8只新西蘭大白兔背部皮下，同時取4只作為單純多孔支架材料的對照。于術后觀察實驗兔的體征、飲食、飲水、切口局部的反應等，4周和8周實驗兔安樂死后取標本周邊軟組織進行大體觀察及組織學檢查，標本的大體觀察、常規(guī)組織學及免疫組織化學染色觀察。術后4周、8周，標本周緣的軟組織行石蠟包埋，常規(guī)HE染色;所有標本一分為二切開，部分標本做冰凍切片，DAPI復染，熒光顯微鏡下示

11、蹤BMSCs、OCN免疫熒光及ALP免疫組化;另一部分進行石蠟包埋，行HE染色、OCN、Ⅰ型膠原免疫組化檢測。
　　結果:經FK506表面修飾的N-PLA/β-TCP多孔支架與BMSCs的復合物及該單純多孔支架在植入新西蘭大白兔背部皮下后，術后均未見明顯的異常體征、飲食、飲水、體重等，手術切口處未見明顯的紅、腫、熱或明顯的包囊結構等異常表現(xiàn)。術后4周、8周，實驗兔安樂死后，各組標本周緣的軟組織大體觀及組織學均未見明顯的炎癥等異常表

12、現(xiàn);標本熒光顯微鏡下觀察見DiI標記的細胞存活于多孔支架中，Brdu標記的細胞可見與Brdu抗體的結合反應，進一步說明在該類型多孔支架中BMSCs可以正常存活生長。4周時，5組標本經常規(guī)HE染色及免疫組化檢測后，6％組的新生編織骨量明顯較其他各組均增多（P＜0.05），6％組的ALP、OCN、ColⅠ等成骨指標陽性表達率經半定量評分均較其他各組有不同程度的提高(P＜0.05);8周時，6％與8％組的新生編織骨量明顯較其他各組均增多(P＜