FK506對癲癇大鼠凋亡細胞數(shù)及MMP和AIF表達影響的研究.pdf

1、背景及目的：癲癇是一種的常見的疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)僅次于腦血管疾病的第二大病種，嚴重影響病人生活質(zhì)量，近幾年來，癲癇的相關(guān)研究雖然在許多方面已經(jīng)取得了很大進展，但其發(fā)病機制仍不十分清楚。其中作為最常見神經(jīng)科急癥癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)，其發(fā)病機制和藥物治療的研究已經(jīng)成為近年來癲癇研究的熱點之一。
　　 SE是癲癇連續(xù)發(fā)作之間意識尚未完全恢復(fù)又頻繁再發(fā)，或癲癇發(fā)作持續(xù)30分鐘以上不自行停止。癲癇持續(xù)狀態(tài)若不及時治療可因神經(jīng)元損傷導(dǎo)致永久性

2、腦損害，目前研究的熱點主要在關(guān)于癲癇的腦損害具體機制及其藥物治療的方面。
　　 大量數(shù)據(jù)表明，癲癇持續(xù)狀態(tài)可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的產(chǎn)生。線粒體在細胞凋亡中的作用密切受到關(guān)注并逐步成為目前研究熱點之一。相關(guān)研究報道指出線粒體跨膜電位對維持線粒體正常功能是必要的，在凋亡細胞的形態(tài)學(xué)改變之前，均出現(xiàn)線粒體膜電位的下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔的不可逆開放導(dǎo)致線粒體體積發(fā)生改變，相關(guān)的凋亡因子釋放入胞漿，引起細胞凋亡。
　　 凋亡誘導(dǎo)因子

3、可(AIF)以不通過caspase途徑引起凋亡，當細胞受到凋亡誘導(dǎo)刺激后，凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體被釋放出來，獲能后易位到細胞核，在核中與染色體結(jié)合，引起染色質(zhì)凝縮與片段化，從而引起細胞凋亡。FK506為一種新型免疫抑制劑，廣泛用于控制器官移植后的排斥反應(yīng)，不過最近有研究發(fā)現(xiàn)FK506尚有免疫抑制以外的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用，但其具體作用機制尚待進一步研究。
　　 本研究通過建立匹魯卡品誘導(dǎo)的大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，研究癲癇引起的細胞

4、凋亡及FK506對線粒體和AIF的影響，為其抗癲癇及腦保護作用提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)利用腹腔注射給藥的方法建立匹魯卡品誘導(dǎo)的大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。隨機將健康Wistar大鼠分為正常對照組（Control組）36只，癲癇模型組（Pilo組）36只，F(xiàn)K506腦保護組（FK506組）36只。FK506腦保護組在造模前24小時及1小時共兩次注射FK506。正常對照組在造模前24小時及1小時共兩次應(yīng)用生理

5、鹽水。SE終止后24h進行心臟灌注，分離新鮮海馬組織，-80度保存，行TUNEL凋亡、線粒體膜電位及免疫組化檢測。
　　 (2)根據(jù)Racine分級觀察大鼠癲癇發(fā)作行為變化，記錄癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作程度。
　　 (3)用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞用共聚焦顯微鏡(OLYMPUS FV1000)觀察神經(jīng)元凋亡的病理學(xué)變化，每張切片取2個400倍視野，綠色的為凋亡細胞。
　　 (4)用流式細胞儀檢測

6、線粒體膜電位及線粒體大小取新鮮海馬組織，用線粒體提取試劑盒提取線粒體，再用濃度為10μmol的羅丹明123染液0.5mL，室溫染色30min，300目尼龍網(wǎng)過濾，上流式細胞儀，用CELL Quest軟件分析。
　　 (5)應(yīng)用免疫組化方法檢查凋亡誘導(dǎo)因子組織切片經(jīng)過固定及脫石蠟處理，枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)，一抗?jié)舛葹?：300。按常規(guī)SABC法進行免疫組化檢測，TAB染色，以PBS取代一抗和二抗作空白對照。應(yīng)用HPIAS-1000

7、高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)對切片進行圖像分析。同一檢測目的的所有切片分析均在同一強度，每張切片取2個400倍視野，免疫組化中出現(xiàn)棕黃色細胞為陽性表達。
　　 (6)采用SPSS10.0軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以(x)±s表示。采用兩兩比較的t檢驗及方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、FK506抑制癲癇發(fā)作：癲癇組、FK506腦保護組大鼠在注射匹魯卡品后均出現(xiàn)癲癇發(fā)作，開始發(fā)作程度較輕

8、，逐漸加重，直至癲癇持續(xù)狀態(tài)。但是潛伏期和發(fā)作強度有所不同。FK506組大鼠的潛伏期延長（P＜0.05），且發(fā)作強度級別降低(P＜0.05)。
　　 2、FK506減少癲癇后神經(jīng)細胞凋亡：在共聚焦顯微鏡下，SE后大鼠神經(jīng)凋亡細胞數(shù)目較對照組顯著增多(P＜0.05)，應(yīng)用FK506后，癲癇大鼠凋亡細胞較癲癇組明顯降低(P＜0.05)，F(xiàn)K506組及正常對照組無顯著差別(P＞0.05)。
　　 3、FK506減輕線粒體細胞膨

9、脹：凋亡時導(dǎo)致線粒體膨脹，線粒體腫大。正常對照組、FK506組的神經(jīng)元細胞線粒體大小無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對照組和腦保護組比較，癲癇組神經(jīng)元細胞線粒體腫大(P＜0.05)。
　　 4、FK506降低AIF的表達：AIF的陽性細胞呈棕黃色，在胞漿和胞核均有表達，以胞核表達為主；AIF陽性細胞主要分布CA1、CA3區(qū)，F(xiàn)K506組與正常對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）；癲癇組與正常對照組及FK506組比較，AI

10、F的表達顯著增高，統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、癲癇對神經(jīng)細胞有損傷作用，可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡，F(xiàn)K506能減輕癲癇后神經(jīng)細胞的凋亡數(shù)目，提示對癲癇后神經(jīng)元有一定的保護作用。
　　 2、癲癇后首先表現(xiàn)為線粒體膜電位的降低，線粒體發(fā)生腫脹，應(yīng)用FK506后，線粒體腫脹減輕，膜電位降低幅度下降，提示FK506對線粒體有一定的影響，可以為新的神經(jīng)元損傷及保護相關(guān)機制的提供進一步研究。