C-反應(yīng)蛋白在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一組進(jìn)行性發(fā)展的慢性疾病群,其共同的特點(diǎn)是腎功能以不同速度進(jìn)行性惡化,最終進(jìn)展為終末期腎衰竭。腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同途徑,是決定腎臟疾病預(yù)后的主要因素。腎小管間質(zhì)纖維化表現(xiàn)為淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在腎間質(zhì)過(guò)度沉積以及腎小管萎縮缺失。炎癥反應(yīng)是腎間質(zhì)纖維

2、化的啟動(dòng)因子和病理基礎(chǔ),腎小管上皮細(xì)胞在各種一致病因素作用下受損活化,表達(dá)釋放趨化因子和生長(zhǎng)因子,吸引炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),分泌大量ECM,繼而呈隱匿而累積性的細(xì)胞過(guò)度凋亡,導(dǎo)致腎小管萎縮缺失,是造成小管間質(zhì)纖維化、腎功能進(jìn)行性下降的主要因?yàn)椤?br>　　 炎癥是導(dǎo)致和加重腎小管間質(zhì)纖維化,促進(jìn)CKD進(jìn)展的主要因?yàn)?。C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)是近年倍受關(guān)注的一種促炎癥介質(zhì)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CRP只是一種炎癥標(biāo)志物

3、,但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),CRP本身也是一種炎癥介質(zhì)而主動(dòng)參與了炎癥和免疫反應(yīng)過(guò)程。CRP作為主要的急性正時(shí)相蛋白,屬于五聚體蛋白家族成員之一,在感染、炎癥和組織損傷時(shí)的其血清濃度迅速增高。其生物學(xué)作用包括與單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上的Fcγ受體結(jié)合激活受體,介導(dǎo)炎癥反應(yīng),如上調(diào)粘附分子,誘導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生,募集并激活循環(huán)單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞。CRP還具有許多類似免疫球蛋白IgG的特性,CRP可以與特定配體結(jié)合,激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑,加

4、強(qiáng)吞噬細(xì)胞的調(diào)理作用等。
　　 研究表明,CKD隨著腎功能的減退,機(jī)體出現(xiàn)慢性的全身性炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為循環(huán)CRP等正性急性時(shí)相反應(yīng)物持續(xù)的低度增多,有學(xué)者稱其為“微炎癥狀態(tài)”,CRP是慢性炎癥的標(biāo)志物。眾多證據(jù)表明,CRP與慢性腎衰竭患者動(dòng)脈粥樣硬化和心血管病變等并發(fā)癥密切相關(guān)。CRP是否對(duì)CKD的進(jìn)展和腎纖維化產(chǎn)生影響仍不清楚,但已有某些證據(jù)提示CRP可能在CKD發(fā)展中起作用。有研究表明,循環(huán)中高水平的CRP能夠與受損的腎組織

5、細(xì)胞結(jié)合并沉積于包括腎小球、腎小管間質(zhì)、管周微循環(huán)的腎組織中。CRP可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生活性氧,促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá),并可刺激遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞激活MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)合成分泌趨化因子RANTES,提示CRP具有活化損傷腎因有細(xì)胞的作用。
　　 慢性腎臟病患者隨著腎功能的減退,往往出現(xiàn)CRP水平的持續(xù)升高,那么CRP作為一種促炎癥介質(zhì)是否反過(guò)來(lái)促進(jìn)腎功能進(jìn)一步惡化,導(dǎo)致CKD進(jìn)行性發(fā)展?目前還不清楚。因此我們提出C

6、PR可能進(jìn)一步促進(jìn)腎功能惡化的假設(shè):慢性腎臟病時(shí)循環(huán)中增高的CRP通過(guò)受損的腎小球?yàn)V過(guò)膜,進(jìn)入腎小管后與腎小管上皮細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合,使腎小管上皮細(xì)胞受損活化,產(chǎn)生炎癥和致纖維化介質(zhì),引起細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌增多,并誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展,導(dǎo)致CKD的進(jìn)行性發(fā)展。
　　 本研究首先從臨床中觀察分析CRP與CKD患者腎功能減退的關(guān)系。我們測(cè)定了不同時(shí)期CKD患者血和尿CRP水平,分析血和尿CRP水平與腎

7、功能的關(guān)系,初步探討CRP在慢性腎臟病進(jìn)展中的潛在作用。然后以體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞,觀察CRP是否上調(diào)其受體-Fcγ受體表達(dá),促進(jìn)炎癥和致纖維化因子的表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多,以及CRP對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響,從而闡述CRP在CKD進(jìn)展發(fā)生中的作用和機(jī)制,為延緩慢性腎衰竭進(jìn)行件惡化的防治提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 第一章C-反應(yīng)蛋白與慢性腎臟病腎功能進(jìn)展的關(guān)系
　　 目的：探討CRP對(duì)CKD患者腎功能

8、進(jìn)展的影響。
　　 方法:入選56例尚未接受透析的CKD 3-5期住院患者。以CRP 10 mg/L為分割點(diǎn),將56例非透析CKD患者分為炎癥組20例和非炎癥組36例。血清和尿CRP水平采用免疫透射比濁法測(cè)定。腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)采用中國(guó)人簡(jiǎn)化MDRD公式計(jì)算。血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)采用酶學(xué)法測(cè)定。24小時(shí)尿蛋白測(cè)定用雙縮脲法。放射免疫法測(cè)定血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)。根據(jù)CR

9、P不同水平比較腎功能的差異并分析血和尿CRP水平與腎功能減退的相關(guān)性。
　　 結(jié)論:隨著腎功能的減退而出現(xiàn)的慢性炎癥狀態(tài),其標(biāo)志物CRP與腎功能的減退密切相關(guān)。血清CRP及尿中CRP與腎小球?yàn)V過(guò)率成負(fù)相關(guān),提示CRP本身作為一種重要的促炎介質(zhì)有可能參與了CKD進(jìn)展的發(fā)生。
　　 第二章C-反應(yīng)蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞Fcy受體表達(dá)的影響
　　 目的：以體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)為靶細(xì)胞,觀察CRP對(duì)

10、腎小管上皮細(xì)胞Fcγ受體表達(dá)的影響并鑒定Fcγ受體的亞型。
　　 方法:以CRP0、0.1、1、10 μg/ml濃度干預(yù)HK-2細(xì)胞24h,采用RT-PCR和Real-timePCR分別檢測(cè)FcγR I(CD64)、FcγR Ⅱ a(CD32a)、FcγRⅢ(CD16)受體mRNA表達(dá)。唯有FcγR Ⅱ a(CD32a)mRNA表達(dá)。為進(jìn)一步鑒定CRP對(duì)HK-2細(xì)胞表面FcγRⅡa表達(dá)的影響,HK-2細(xì)胞在10μg/ml CRP

11、培養(yǎng)24h后,分別采用流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦顯微鏡和Western blot法檢測(cè)FcγR Ⅱ a蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:人近端腎小管上皮細(xì)胞存在FcγRⅡa表達(dá),CRP刺激可上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞表面的FcγRⅡa受體的表達(dá),提示CRP可以通過(guò)對(duì)Fcγ RⅡa的結(jié)構(gòu)識(shí)別和功能活化介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。
　　 第三章 C-反應(yīng)蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞促纖維化因子和炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響
　　 目的：觀察CRP刺激是否誘導(dǎo)腎小

12、管上皮細(xì)胞致纖維化和炎癥因子表達(dá)并導(dǎo)致ECM的積聚。
　　 方法:HK-2細(xì)胞分別與0、0.1、1、10、20μg/ml CRP共孵育24h； 101μg/ml CRP培養(yǎng)0、12、24、48h,采用ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)和ECM成分Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)、和Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)的水平。以CRP 0、0.1、1、10μg/ml濃度刺激HK-2細(xì)胞24h；用10μg/mlC

13、RP培養(yǎng)0h、12h、24h、48h,Real-time PCR TGF β1檢測(cè)mRNA表達(dá)。以CRP 0、0.1、1、10μg/ml濃度刺激HK-2細(xì)胞24h；用10μg/mlCRP培養(yǎng)0h、6h、12h、24h,Real-time PCR檢測(cè)趨化因子CX3CLl(Fractalkine)mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論:CRP刺激上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞致纖維化因子TGFβ1和趨化因子CX3CL1表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)Col Ⅰ、Col

14、Ⅳ分泌增多,提示CRP對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的活化具有促炎癥和纖維化作用。
　　 第四章 C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡
　　 目的：探討CRP對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響
　　 方法:以0、0.1、1、10、20μg/ml CRP和CRP10μg/m1+抗CRP抗體10μg/ml刺激HK-2細(xì)胞48小時(shí)；10μg/mlCRP孵育HK-2細(xì)胞0h、12h、24h、48h,采用AnnexinV-FITC和PI染色,流式

15、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分率。Hoechst33258染色檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。比色法檢測(cè)Caspase-3活性,Real-time PCR檢測(cè)凋亡基因BAX、Bc1-2 mRNA的表達(dá)。Real-time PCR檢測(cè)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯與凋亡的基因GADD153 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)論:CRP可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,提示其具有引起腎小管萎縮的潛在能力。誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制與Caspase-3凋亡酶活化,促凋亡基因BA

16、X、GADD153上調(diào),抑制凋亡基因Bc1-2下調(diào)有關(guān)。
　　 第五章 FcγRⅡa受體在C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)中的作用
　　 目的：通過(guò)FcγRⅡa抗體封閉FcγRⅡa受體,觀察CRP誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)的變化,探討腎小管上皮細(xì)胞FcγRⅡa受體在CRP誘導(dǎo)的病理生物學(xué)效應(yīng)中的作用。
　　 方法:以CRP0μg/ml、CRP 10μg/ml、CRP10μg/ml+IgG10μg/ml、CRP10μg/ml+抗

17、FcγRⅡa(CD32a)抗體10μg/ml刺激HK-2細(xì)胞24 h或48h,分別采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TGFβ1濃度和細(xì)胞外基質(zhì)ColⅠ、ColⅣ濃度；Real-time PCR檢測(cè)TGFβ1和趨化因子CXC3CL1 mRNA表達(dá)AnnexinV-FITC和PI染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分率。
　　 結(jié)論:CRP通過(guò)腎小管上皮細(xì)胞FcγRⅡa受體介導(dǎo)促纖維化因子TGFβ1和趨化因子CXC3CL1表達(dá)上調(diào),促進(jìn)H