核磷酸酶SCP4在慢性腎臟病肌肉萎縮中作用機(jī)制的研究.pdf

1、肌肉萎縮是多種疾病的常見并發(fā)癥；慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）及與其相關(guān)的炎性細(xì)胞因子刺激蛋白質(zhì)能量消耗（protein energy wasting,PEW），這種復(fù)雜的過程表現(xiàn)為肌肉質(zhì)量的持續(xù)丟失。而導(dǎo)致肌肉損失是一個復(fù)雜的病理生理過程，主要是加速蛋白質(zhì)的降解實現(xiàn)的，然而這些蛋白質(zhì)水解過程中的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本課題主要研究核內(nèi)小分子磷酸酶SCP4/CTDSPL2（the small C-

2、terminal domain phosphatase4/the C-terminal domain small phosphatase like2）通過調(diào)節(jié)FoxO1、3信號通路影響肌肉蛋白質(zhì)代謝；在CKD時由于NF-κB被激活而刺激SCP4表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)肌肉蛋白降解。
　　第一部分：SCP4在肌肉蛋白代謝中的作用機(jī)制研究
　　目的：
　　旨在研究核磷酸酶SCP4/CTDSPL2如何通過調(diào)控FoxO轉(zhuǎn)錄因子影響肌

3、肉蛋白質(zhì)的代謝，為臨床防治肌肉萎縮提供新的治療靶點。
　　方法：
　　采用細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)使成肌細(xì)胞C2C12的SCP4基因抑制或過表達(dá)。過表達(dá)及對照組分別轉(zhuǎn)染GFP-SCP4和GFP，然后分別加入蛋白酶體和溶酶體抑制劑、IGF-1和BMP2處理細(xì)胞；在基因抑制組分別轉(zhuǎn)染SCP4-siRNA(siSCP4)和scrambled(siCTL)。采用同位素檢測技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的分解和合成；PCR微陣列分析SCP4過表達(dá)時與骨骼肌

4、代謝、功能及疾病相關(guān)的基因表達(dá)變化；磷酸化蛋白微陣列檢測在細(xì)胞SCP4基因抑制后多種蛋白磷酸化水平的變化。采用western-blot檢測各組Akt、FoxO1、FoxO3a的蛋白表達(dá)及SCP4的轉(zhuǎn)染效率；Real-time PCR檢測各組Atrogin-1、 MuRF-1、MUSA1、Myostatin的mRNA表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察活細(xì)胞FoxO1出入細(xì)胞核的變化。采用電轉(zhuǎn)染技術(shù)使局部肌肉SCP4過表達(dá)進(jìn)行體內(nèi)實驗，免疫熒光

5、染色觀察肌纖維橫截面積。
　　結(jié)果：
　　1)在骨骼肌細(xì)胞SCP4調(diào)控FoxOs和Smads信號通路；
　　2)SCP4過表達(dá)促進(jìn)成肌細(xì)胞蛋白水解；
　　3)SCP4過表達(dá)促進(jìn)肌肉損傷基因Atrogin-1、MuRF-1、MUSA1和Myostatin的表達(dá)；
　　4)過表達(dá)SCP4使FoxO1、FoxO3a去磷酸化增加，抑制其出核；
　　5)在正常小鼠中過表達(dá)SCP4也足以引起肌纖維萎縮。
　

6、　結(jié)論：
　　SCP4通過調(diào)控FoxO1、FoxO3a的出入核，增加其轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)損傷因子的表達(dá)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水解，肌肉萎縮。即使磷酸化Akt發(fā)生變化，過表達(dá)SCP4也能使FoxO1留在細(xì)胞核內(nèi)，表明SCP4的是一種新的FOxO轉(zhuǎn)錄因子和蛋白水解信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，可能為預(yù)防肌肉萎縮提供治療的新靶點。
　　第二部分：抑制SCP4基因可防止慢性腎臟病誘導(dǎo)的肌肉萎縮
　　目的：
　　旨在探討抑制SCP4基因在饑餓

7、及慢性腎臟病誘導(dǎo)的肌肉萎縮中的保護(hù)作用。
　　方法：
　　使用電轉(zhuǎn)染技術(shù)使C2C12細(xì)胞SCP4基因敲抑，建立饑餓模型，轉(zhuǎn)染scrambled組（siCTL）、轉(zhuǎn)染scrambled+無血清培養(yǎng)（siCTL-SF）組、轉(zhuǎn)染SCP4-siRNA（siSCP4）組、轉(zhuǎn)染SCP4-siRNA+無血清培養(yǎng)組（siSCP4-SF），同位素法檢測蛋白降解率；建立CKD小鼠模型，采用免疫組化及western-blot檢測其骨骼肌以及健康成

8、人和CKD患者腹直肌SCP4的蛋白表達(dá)；采用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)使CKD小鼠局部肌肉SCP4基因敲抑，分為4組，假手術(shù)+轉(zhuǎn)染scrambled組（Sham+siCTL）、CKD+轉(zhuǎn)染scrambled組（CKD+siCTL）、假手術(shù)+轉(zhuǎn)染siSCP4組（Sham+siSCP4）、CKD+轉(zhuǎn)染SCP4組（CKD+siSCP4），肌纖維的橫截面積用免疫熒光染色觀察；western-blot檢測各組Akt、FoxO1、FoxO3a的蛋白表達(dá)；Rea

9、l-time PCR檢測各組Atrogin-1、MuRF-1、MUSA1、Myostatin的mRNA表達(dá)。CKD相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6，IFN-γ、LPS及其混合物和QNZ（NF-κB抑制劑）作用于C2C12細(xì)胞，檢測細(xì)胞SCP4 mRNA和蛋白水平的變化；采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP assay）來檢測NF-κB（p65）蛋白是否與SCP4基因啟動子序列相關(guān)。
　　結(jié)果：
　　1) SCP4基因敲抑可以降低饑餓誘導(dǎo)的

10、蛋白降解率，抑制FoxO1/3a的轉(zhuǎn)錄活性，降低肌肉損傷因子的表達(dá)；
　　2)慢性腎臟病時肌肉中核磷酸酶SCP4表達(dá)增加，抑制SCP4基因可以防止CKD小鼠的肌肉萎縮；
　　3)CKD相關(guān)炎性因子可以刺激肌細(xì)胞SCP4表達(dá)增加；轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p65）蛋白與SCP4基因啟動子序列相關(guān)；QNZ處理C2C12細(xì)胞后，幾乎完全阻斷由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的SCP4表達(dá)的增加。
　　結(jié)論：
　　CKD時NF-κB被激活從而介導(dǎo)