甲狀腺相關性眼病眼眶成纖維細胞亞型與功能研究.pdf

1、研究目的：甲狀腺相關眼病的病理改變包括眼外肌纖維化、糖胺聚糖積聚、眶脂肪容積增多。本研究旨在檢測培養(yǎng)的眼眶成纖維細胞是否存在不同的表型，表達CD90抗原有差異，并依據是否表達CD90分為兩個亞群，分離這兩個細胞亞群，分別進行肌成纖維和脂成纖維細胞誘導，研究他們在眼外肌纖維化、脂肪堆積和有害的炎癥中所起的不同的作用，從而解釋甲狀腺相關眼病的一系列臨床病理改變，證實成纖維細胞是甲狀腺相關眼病的關鍵效應細胞，有著高度嚴格的分工，并為進一步闡明

2、甲狀腺相關眼病的發(fā)病機理提供新思路，為將來研制能阻斷脂肪積聚或眼外肌纖維化的藥物或蛋白用以有針對性地治療該病提供理論依據。 方法：1.培養(yǎng)TAO病人和正常對照眼眶成纖維細胞，流式細胞術檢測CD90的表達。 2.免疫磁分離法分離CD90+和CD90-的眼眶成纖維細胞，免疫細胞化學法和流式細胞術鑒定。 3.TGF-β1誘導CD90+和CD90-成纖維細胞亞群轉化為肌成纖維細胞(MFB)，免疫細胞化學法檢測代表MFB標

3、志的平滑肌動蛋白α-SMA的表達情況。 4.分別誘導CD90+和CD90-成纖維細胞亞群轉化為脂成纖維細胞，比較轉化率。 5.RT-PCR法檢測MFB誘導過程中CD90+和CD90-成纖維細胞亞群表達代表MFB標志的α-SMAmRNA、TGF-β1的下游基因結締組織生長因子CTGFmRNA的情況，分析時間和劑量效應關系。 6.RT-PCR法檢測MFB誘導過程中CD90+和CD90-成纖維細胞亞群表達與糖胺聚糖合成

4、相關的透明質酸合成酶基因HASl、HAS2、HAS3，與炎癥相關的環(huán)氧化酶COX2基因表達的影響，更進一步了解CD90+和CD90-眼眶成纖維細胞在TAO眼外肌纖維化、ECM聚積和炎癥過程中的作用。 結果：1.正常人、TAO患者的眼外肌、眼眶脂肪/結締組織來源的成纖維細胞均有部分細胞表達CD90。眼外肌來源的成纖維細胞中CD90+的細胞比例高于眼眶脂肪/結締組織來源的成纖維細胞。 2.成功地將眼眶成纖維細胞分離成兩個亞群

5、。CD90+細胞群純度大于98％；CD90-細胞群純度大于95％。分離后的細胞經傳代表型不變化。 3.在TGF-β1的作用下，CD90+眼眶成纖維細胞于48小時后部分細胞開始出現(xiàn)α-SMA弱表達，4天時大部分細胞呈陽性。CD90-眼眶成纖維細胞不表達α-SMA。 4.眼外肌來源CD90+成纖維細胞基本不能轉化為脂成纖維細胞。眼外肌來源的CD90-成纖維細胞、眼眶脂肪/結締組織來源的CD90+成纖維細胞、眼眶脂肪/結締組織

6、來源的CD90-脂成纖維細胞轉化率分別為：10％、40％、72％。 5.TAO眼眶成纖維細胞在靜息狀態(tài)有一定的CTGF、α-SMA、HAS1、HAS3mRNA表達。部分病人的細胞表達HAS2mRNA，基本不表達COX2mRNA。 6.TGF-β1上調CTGFmRNA表達，3小時起效，12小時達峰值，此時CD90+細胞CTGFmRNA表達約為對照的13倍，CD90-成纖維細胞CTGF增加幅度較小，于3小時時增加至空白組的3

7、倍后不再上升。lng/ml及以上的濃度TGF-β1均能有效地刺激CD90+細胞CTGF的表達增加，lng/ml的濃度的TGF-β1作用小于其他較高的濃度，5ng/ml及以上的濃度作用相當，組間兩兩分析無差異。lng/mlTGF-βl不能顯著提高CD90-眼眶成纖維細胞細胞CTGF的表達，5ng/ml及以上的濃度作用相當，組間兩兩分析無差異。 7.TGF-β1上調α-SMAmRNA表達，CD90+細胞于24小時達峰值，并持續(xù)較長時

8、間，約為靜息狀態(tài)的35倍；CD90-細胞α-SMA基因增加幅度明顯比CD90+細胞低，于作用3小時后，漲至靜息狀態(tài)的4倍時就不再增加，維持至12小時，然后緩慢下降。lng/ml及以上的濃度TGF-β1均能有效地刺激CD90+細胞和CD90-細胞α-SMAmRNA的表達增加(P＜0.01)，各種濃度的TGF-β1作用相當，組間兩兩分析無顯著差異。 8.TGF-β1處理CD90+和CD90-眼眶成纖維細胞均于3小時開始HAS1表達明

9、顯增加，6-12小時達峰值。TGF-β1所導致的CD90+細胞HAS1表達增加最高可達基礎水平的30倍左右，明顯高于CD90-細胞的8倍。大多數TAO患者的眼眶成纖維細胞經TGF-β1處理后，仍未能檢測出HAS2表達。TGF-β1下調HAS3表達下降，12小時時作用最強，CD90+細胞下降到空白組的20％左右，并保持至整個實驗觀察期(48小時)。CD90-細胞下降到空白組的39％左右，維持至24小時。不同濃度的TGF-β1對CD90+和

10、CD90-眼眶成纖維細胞表達HAS1、HAS2、HAS3的影響沒有明顯差異。 9.經TGF-β1處理后，CD90+和CD90-眼眶成纖維細胞均未檢測出COX2基因表達。 結論：眼眶成纖維細胞表達CD90抗原不一致，存在至少兩個細胞亞群，眼外肌來源的成纖維細胞以CD90+細胞為主，眶脂肪/結締組織來源的成纖維細胞中含有較多的CD90-細胞。免疫磁珠分離法可有效地分離CD90+與CD90-細胞群。分離后的眼眶成纖維細胞表達C

11、D90穩(wěn)定，與培養(yǎng)、傳代無關。CD90+與CD90-細胞群具有不同的功能，CD90+細胞群具有轉化為MFB的潛能，與眼外肌纖維化、糖胺聚糖積聚有關；CD90-細胞群包括了具有脂肪細胞轉化潛能的細胞群。TGF-β1上調CD90+成纖維細胞CTGF、α-SMAmRNA表達，TGF-β1通過CTGF介導CD90+成纖維細胞轉化為MFB，并以獨特的方式參與細胞外基質的代謝：上調HAS1，下調HAS3。TGF-β1和MFB并不通過影響PGE2的合