吡非尼酮抑制眼眶成纖維細胞應力纖維及粘著斑重構(gòu)作用和細胞功能的實驗研究.pdf

1、第一部分：眼外肌來源成纖維細胞的原代培養(yǎng)、鑒定及誘導分化
　　目的：研究TAO眼外肌來源的成纖維細胞，在TGF-β1作用下的細胞生長分化狀態(tài)。
　　方法：通過組織塊培養(yǎng)法收集TAO眼外肌來源的成纖維細胞，進行細胞形態(tài)及免疫標記物鑒定為成纖維細胞；通過MTT法觀察成纖維細胞在不同濃度TGF-β1（1μg/L、5μg/L、10μg/L）誘導后的增殖效應；通過免疫細胞化學法檢測成纖維細胞表達α-SMA；通過Western檢測不同濃

2、度（1μg/L、5μg/L、10μg/L）和時間（24h、48h、72h）效應下，TGF-β1誘導成纖維細胞表達α-SMA水平。
　　結(jié)果：⑴原代和傳代培養(yǎng)的細胞呈長梭形，胞漿豐滿，核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，細胞融合后呈放射狀、漩渦狀排列緊密；免疫細胞化學染色顯示：vimentin陽性表達，Desmin、Kerati、S-100、第Ⅷ因子呈陰性反應，可以鑒定TAO組和正常對照組眼外肌標本培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。⑵MTT法檢測TG

3、F-β1誘導72h后的成纖維細胞增殖率具有劑量效應，10μg/L TGF-β1組細胞增殖率最高，為107.35％（P﹤0.05）；TAO組和正常對照組的成纖維細胞MTT光密度值比較，差別不具有統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。⑶10μg/L TGF-β1處理24h，成纖維細胞胞漿豐滿，體型增大，細胞足突增多；免疫細胞化學染色顯示胞漿內(nèi)大量α-SMA表達，強陽性染色；陰性處理組細胞內(nèi)表達α-SMA量少。⑷Western-blot檢測TGF-β1

4、誘導成纖維細胞表達α-SMA蛋白具有劑量和時間效應，10μg/L TGF-β1處理48h具有最大表達量（P﹤0.05）；TAO組和正常對照組的成纖維細胞α-SMA蛋白表達量相互比較，差別不具有統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。
　　結(jié)論：利用組織塊貼壁法培養(yǎng)的成纖維細胞的形態(tài)學和免疫學特征明顯，可用于甲狀腺相關眼病的體外研究對象。TGF-β1具有促進成纖維細胞增殖和向肌纖維母細胞分化作用，其誘導的α-SMA表達水平增高在一定范圍內(nèi)具有濃

5、度和時間依賴性。
　　第二部分：吡非尼酮抑制成纖維細胞增殖、分化、遷移及收縮功能的實驗研究
　　目的：研究吡非尼酮對TAO眼外肌成纖維細胞的增殖、分化、遷移和收縮膠原作用的影響。
　　方法：在不同濃度TGF-β1、吡非尼酮、地塞米松作用下，通過MTT法檢測成纖維細胞增殖作用，臺盼藍染色法檢測細胞存活狀態(tài)。在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮、1000nM地塞米松作用下，利用劃痕實驗檢測細胞遷移作用，免

6、疫細胞化學法檢測細胞表達α-SMA、fibronectin的作用，以及凝膠收縮實驗檢測細胞收縮膠原的作用。
　　結(jié)果：⑴MTT法檢測吡非尼酮抑制成纖維細胞增殖率具有劑量效應，0.5mg/ml、1.0mg/ml吡非尼酮的72h細胞增殖率，分別為-24.82%、-41.84%，二者MTT值與空白對照組比較，P﹤0.05；吡非尼酮較地塞米松具有更強的抑制 TGF-β1誘導的細胞增殖作用（P﹤0.05）。⑵臺盼藍染色法觀察不同濃度吡非尼酮

7、作用72h后，成纖維細胞活性良好，未見明顯細胞毒性作用。⑶細胞劃痕實驗顯示，TGF-β1具有促進細胞遷移和融合效應；吡非尼酮抑制細胞遷移作用明顯（P﹤0.05）。⑷免疫細胞化學染色顯示，吡非尼酮作用72h后成纖維細胞內(nèi)無明顯α-SMA表達；地塞米松組成纖維細胞內(nèi)正常表達α-SMA。空白對照組、TGF-β1組、地塞米松組72h后均可見fibronectin在成纖維細胞內(nèi)外高表達，并聚合成互相連接的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；吡非尼酮組、吡非尼酮聯(lián)合TG

8、F-β1組72h后fibronectin表達被抑制。⑸凝膠收縮實驗顯示，連續(xù)觀察6天后，TGF-β1組的收縮指數(shù)為59.38%，與空白對照組比較，顯示強大的促進成纖維細胞介導的膠原收縮作用（P﹤0.05）；吡非尼酮組、吡非尼酮聯(lián)合TGF-β1組的收縮指數(shù)分別為6.70%和8.02%，具有明顯抑制成纖維細胞介導的膠原收縮作用（P﹤0.05）；地塞米松組收縮指數(shù)25.48%，與空白對照組比較無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。
　　結(jié)論：吡

9、非尼酮可抑制體外培養(yǎng)眼眶成纖維細胞的增殖和向肌纖維母細胞表型分化；抑制成纖維細胞/肌纖維母細胞的遷移和膠原收縮作用；并且對fibronectin的表達也有明顯的下調(diào)作用。吡非尼酮較地塞米松具有更強的抑制TGF-β1介導的成纖維細胞增殖、分化、遷移和膠原收縮作用。
　　第三部分:吡非尼酮抑制眼眶成纖維細胞應力纖維重構(gòu)及粘著斑成熟作用的實驗研究
　　目的：研究吡非尼酮對TGF-β1誘導下的TAO眼外肌成纖維細胞的肌動蛋白應力纖維

10、構(gòu)建和粘著斑成熟分化的作用，以及相關信號通路的影響。
　　方法：在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮作用下，利用免疫熒光技術和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察肌動蛋白應力纖維、粘著斑蛋白和Ⅰ型膠原形態(tài)及細胞定位，Western-blot檢測Akt、Phospho-Akt、FAK、Phospho-FAK蛋白的表達，以及通過MaxGelTM檢測成纖維細胞在細胞外基質(zhì)中的粘附作用。
　　結(jié)果：⑴共聚焦顯微鏡下觀察，吡非尼

11、酮抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞向肌纖維母細胞分化，降低α-SMA陽性應力纖維構(gòu)建；抑制paxillin、tensin蛋白表達，抑制粘著斑分化成熟，相應粘著斑面積和數(shù)量較空白對照組減?。≒﹤0.05）。⑵Western Blot結(jié)果顯示，吡非尼酮單獨作用或聯(lián)合TGF-β1均可抑制Akt與磷酸化Akt，F(xiàn)AK與磷酸化FAK表達（P﹤0.05）；吡非尼酮對Akt磷酸化抑制作用更明顯（P﹤0.05）。⑶細胞粘附實驗表明，吡非尼酮作用24h后