人異體骨軟骨移植物保存方法的研究.pdf

1、目的: 通過比較慢速梯度降溫法、Co60射線照射+慢速梯度降溫法、玻璃化法、慢速連續(xù)降溫法、直接液氮法、酒精浸泡法對關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)、軟骨細胞存活率及軟骨細胞活性的不同影響，篩選出保存效果較好的方法，為臨床提供一種有活性的異體骨軟骨移植物。 方法: 異體骨軟骨標本主要來源于泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院和山東省千佛山醫(yī)院臨床腦死亡病人，無關(guān)節(jié)病損，捐獻者年齡控制在15歲-45歲之間。死前做血尿及其他體液的常規(guī)檢查。無菌條件下

2、，快速用空心鉆在內(nèi)外側(cè)股骨髁關(guān)節(jié)面切取直徑約為4．5mm的圓柱形骨軟骨塊，軟骨及所帶軟骨下骨全長約5mm，共500枚，PBS液沖洗3遍備用。將骨軟骨塊隨機分為7組，即對照組、慢速梯度降溫組、Co60射線照射+慢速梯度降溫組、玻璃化組、慢速連續(xù)降溫組、直接液氮組、酒精浸泡組。對照組不采取任何措施，20min內(nèi)直接取材檢測軟骨細胞存活率、軟骨細胞活性并觀察其超微結(jié)構(gòu)。慢速梯度降溫組是把標本在降至-40℃以前分4個梯度降溫的保存方法；Co60

3、射線照射+慢速梯度降溫組是將骨軟骨塊用Co60射線50Gy劑量照射2個小時后按照慢速梯度降溫法保存；玻璃化組即將標本經(jīng)玻璃化溶液處理后直接以最快的速度投入液氮中保存；慢速連續(xù)降溫組即傳統(tǒng)降溫方法，將經(jīng)低溫保護劑處理后的標本分兩步降溫保存；直接液氮組是將骨軟骨塊經(jīng)過低溫保護劑處理后直接投放入液氮中保存；酒精浸泡組即將骨軟骨塊浸泡入75％的酒精中維持72小時，然后更換95％的酒精，4℃保存。各實驗組軟骨標本于保存8天、15天、30天、60天

4、時取出做臺盼藍檢測軟骨細胞存活率；MTT檢測軟骨細胞活性（OD值的大小反映軟骨細胞的活性）；進行組織學和組織化學檢測觀察軟骨細胞組織形態(tài)和代謝活性變化（番紅O染色顯示軟骨基質(zhì)蛋白多糖PG變化）；透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)變化。并以新鮮組作為對照組，對實驗組軟骨組織保存情況進行比較。 結(jié)果: 1．關(guān)節(jié)軟骨PG的變化關(guān)節(jié)軟骨保存8天時，慢速梯度降溫組、Co射線照射+慢速梯度降溫組和慢速連續(xù)降溫組PG含量（IOD）值同對照組比較

5、有統(tǒng)計學差異（P<0．05），Co60射線照射+慢速梯度降溫組同慢速連續(xù)降溫組比較沒有統(tǒng)計差異；關(guān)節(jié)軟骨保存15天時，慢速梯度降溫組、Co60射線照射+慢速梯度降溫組和慢速連續(xù)降溫組PG含量同對照組比較減少均有統(tǒng)計學差異（P<0．05），慢速梯度降溫組同Co60射線照射+慢速梯度降溫組和慢速連續(xù)降溫組比較有統(tǒng)計學差異（P<0．05）；保存30天時，慢速梯度降溫組同Co60射線照射+慢速梯度降溫組和慢速連續(xù)降溫組比較有統(tǒng)計學差異（P<0．

6、05）；保存60天時，慢速梯度降溫組、Co60射線照射+慢速梯度降溫組和慢速連續(xù)降溫組兩兩比較有統(tǒng)計學意義。慢速梯度降溫組、Co60射線照射+慢速梯度降溫組和慢速連續(xù)降溫組，四個時間點，這三個實驗組內(nèi)比較，保存處理對PG影響有時間依從性，即保存8天、15天、30天和60天組內(nèi)兩兩比較有統(tǒng)計學差異（P<0．05）。玻璃化組、直接液氮組和酒精浸泡組PG含量隨保存沒有時間依從性，即組內(nèi)比較沒有統(tǒng)計學意義。直接液氮組同對照組比較有統(tǒng)計學差異，玻

7、璃化組、酒精浸泡組在不同時間點上兩兩比較均沒有統(tǒng)計學意義。 2．軟骨細胞存活率的變化對照組軟骨細胞存活率為96．63±0．56，保存8天、15天、30天和60天時，各實驗組同對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0．05），各實驗組組間兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（P<0．05）。除酒精浸泡組外，各實驗組組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（P<0．05），即保存處理對各組軟骨細胞存活率的影響具有動態(tài)時間依從性。酒精浸泡組經(jīng)實驗檢測無存活軟骨細胞。

8、 3、軟骨細胞的活性對照組的OD值0．66±0．05。保存8天，各實驗組同對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0．05），慢速梯度降溫組同玻璃化組、Co60照射+梯度降溫法同慢速連續(xù)降溫組比較沒有統(tǒng)計學意義，其兩者比較有統(tǒng)計學意義（P<0．05）；保存15天，各實驗組同對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0．05），Co60照射+梯度降溫法同慢速連續(xù)降溫組比較沒有統(tǒng)計學意義，其它各組兩兩比較有統(tǒng)計學意義（P<0．05）；保存30天，組間比較同保

9、存15天；保存60天，各實驗組同對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0．05），各實驗組組間兩兩比較均有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。各實驗組組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，即保存處理對各實驗組OD值的影響具有動態(tài)時間依從性。 結(jié)論: 1、慢速梯度降溫法和玻璃化法能夠明顯減輕關(guān)節(jié)軟骨的組織凍傷，提高保存軟骨的活性，有一定的臨床應用價值。 2、酒精浸泡法只能保存軟骨的組織結(jié)構(gòu)，其他保存方法對關(guān)節(jié)軟骨活性的影響均具有動態(tài)的時間依

10、從性，隨著時間的延長，關(guān)節(jié)軟骨活性逐漸降低。 3、Co60射線照射+梯度降溫法與梯度降溫組比較軟骨細胞存活率降低，說明Co60射線照射對軟骨有一定的損傷作用。 意義：關(guān)節(jié)軟骨缺損臨床上很常見，而且治療很棘手，多種治療手段已運用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復，但大多數(shù)療效不理想，修復組織也以纖維軟骨為多，缺乏正常透明軟骨的生物力學性能及耐用性。組織工程可以很好的用于軟骨缺損的治療，但目前仍處于探索階段。骨軟骨移植可以將完整的正常的關(guān)