熒光多參量顯微技術(shù)研究.pdf

1、熒光光譜技術(shù)和熒光顯微技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的強(qiáng)大工具。將熒光光譜學(xué)參數(shù)和熒光顯微測量相結(jié)合既提供了高度的分子結(jié)構(gòu)特異性和微環(huán)境變化信息，又提供了高的空間分辨率。生物醫(yī)學(xué)發(fā)展對檢測和成像系統(tǒng)的一個要求是在一次測量中能以很高的靈敏度和特異性得到多種功能信息。熒光光譜測量可以鑒別不同的熒光團(tuán)種類；熒光壽命測量可以對熒光分子所處微環(huán)境的pH值、離子濃度(Ca2+、Na+等)、氧壓等生理生化參數(shù)進(jìn)行定量分析，而且對于鑒別光譜嚴(yán)重重疊的多組

2、分熒光團(tuán)非常有用。因此，同時光譜和時間分辨可以提供不同的對比機(jī)制和互補(bǔ)的功能信息，引起了人們的廣泛關(guān)注。生物醫(yī)學(xué)發(fā)展對檢測和成像系統(tǒng)的另一個要求是能夠無損、實(shí)時監(jiān)測活體細(xì)胞的動態(tài)過程。多焦點(diǎn)多光子顯微術(shù)(MMM)可以實(shí)現(xiàn)樣品的三維快速多光子激發(fā)熒光顯微成像，并具有對活體樣品損傷小，成像深度大，圖像信噪比高等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了MMM與熒光壽命測量相結(jié)合的快速成像，但時間分辨率不夠高，更為突出的問題是不能給出光譜分辨信息。針對這些難以解決

3、的問題，本論文主要完成了以下幾方面的研究工作： 1.進(jìn)一步闡明了與本課題密切相關(guān)的熒光顯微術(shù)的理論與技術(shù)問題。 2.提出了一種兩維空間同時光譜分辨技術(shù)，并討論了兩維離散點(diǎn)獲得最佳光譜分辨率的方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在一個面陣探測器上同時記錄兩維空間的光譜圖像，掃描效率隨激發(fā)點(diǎn)數(shù)線性提高。利用它可同時獲得樣品的熒光光譜和二次諧波圖像。 3.參與設(shè)計(jì)和研制了一臺重復(fù)頻率達(dá)到1MHz、可用于兩維空間探測的皮秒同步掃描相機(jī)，發(fā)

4、展了基于掃描相機(jī)的時間分辨單／雙光子激發(fā)熒光光譜技術(shù)，可同時獲取樣品的熒光光譜信息和壽命信息，并對掃描相機(jī)的掃描速度、時間分辨率及非線性等進(jìn)行了標(biāo)定。 4.實(shí)現(xiàn)了一種基于同步掃描相機(jī)的兩維空間同時光譜和時間分辨技術(shù)，把所獲得的離散點(diǎn)的時問分辨光譜圖像看作是在兩維空間的取樣值，通過對樣品的三維精密微位移，即可獲得五維熒光多參量顯微功能圖像。 5．建立和標(biāo)定了基于同步掃描相機(jī)的時間分辨雙光子激發(fā)熒光光譜測量(tr-TPEFS

5、)系統(tǒng)，通過對標(biāo)準(zhǔn)熒光染料及其混合溶液、熒光生物分子的時間分辨熒光光譜測量對系統(tǒng)進(jìn)行了測試，獲得了一種解決組織中多熒光團(tuán)或多組分熒光參數(shù)分離的有效方法，并利用該系統(tǒng)測量了生物樣品的時問分辨自體熒光光譜特性。 6.建立和標(biāo)定了同時光譜和時間分辨多焦點(diǎn)多光子顯微(SSTR-MMM)系統(tǒng)，進(jìn)行了同時光譜和時間分辨采樣成像原理實(shí)驗(yàn)，演示了SSTR-MMM系統(tǒng)的五維熒光顯微成像功能，并初步探索了該技術(shù)在生物組織成像及疾病診斷中的應(yīng)用。利用