多光譜熒光顯微內(nèi)鏡的構(gòu)建和初步成像研究.pdf

1、目的:
　　消化道腫瘤發(fā)病率高、死亡率高，但早期診斷率低、漏診率高，如何提高消化道腫瘤早期檢出率，降低漏診率，是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)問題。本研究在自主研發(fā)的高分辨率顯微內(nèi)鏡（high resolution microendoscopy, HRME)基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光顯微鏡的成像原理，通過優(yōu)化硬件設(shè)備、研發(fā)圖像處理軟件，解決HRME設(shè)備成像光譜相對(duì)單一，成像速度較慢，圖像偽影較多等不足，構(gòu)建一套新型的熒光成像設(shè)備，并將其命名為多光譜熒

2、光顯微內(nèi)鏡（multispectral fluorescence endomicroscopy，MFE）；應(yīng)用MFE觀察日本長耳兔不同部位胃腸道黏膜,分析MFE圖像的特點(diǎn),以病理為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)其成像效果的真實(shí)性和可靠性，探討一種實(shí)現(xiàn)胃腸道粘膜虛擬組織病理成像的新技術(shù)，為提高早期消化道腫瘤的檢出率探索一種新方法。
　　方法:
　　采用30000像元高分辨率光纖束、10×顯微鏡鏡頭、熒光濾光片立方體、sCMOS相機(jī)、三維組合平移臺(tái)及

3、商用光學(xué)配件，構(gòu)建MFE成像系統(tǒng)，并對(duì)該成像系統(tǒng)的光纖耦合效率，系統(tǒng)分辨率，視場大小，成像速度等基本參數(shù)進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)臨床需要，選擇合適的成像光纖。應(yīng)用MFE成像系統(tǒng)對(duì)比色卡，染料擦鏡紙，熒光小球以及植物葉片組織等標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行成像，證明其具備多光譜成像以及對(duì)組織樣品亞細(xì)胞級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光觀察的能力。
　　通過對(duì)日本長耳兔正常食管、胃、小腸、結(jié)腸黏膜及肝臟組織進(jìn)行多光譜成像，驗(yàn)證其實(shí)現(xiàn)虛擬組織病理成像的可行性，并以病理診斷作為圖像

4、判定標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)MFE成像結(jié)果的準(zhǔn)確性。將MFE成像結(jié)果與HRME圖像以及共聚焦激光顯微內(nèi)鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）圖像進(jìn)行比較，分析MFE成像系統(tǒng)的特點(diǎn)，探索MFE成像系統(tǒng)與分子影像技術(shù)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)。
　　為了進(jìn)一步提高圖像質(zhì)量，研發(fā)空間濾波算法，選擇圖像中感興趣區(qū)域，使用二維高斯濾波器對(duì)圖像進(jìn)行處理，去除光纖成像中的網(wǎng)格噪聲，對(duì)圖像進(jìn)行二值化處理，計(jì)算細(xì)胞核輪廓面積。實(shí)現(xiàn)對(duì)正常食管鱗狀

5、上皮和食管鱗狀細(xì)胞癌HRME圖像的定量分析。
　　結(jié)果:
　　成功研發(fā)了一套多光譜熒光內(nèi)窺成像系統(tǒng)。并對(duì)光學(xué)設(shè)計(jì)，參數(shù)組件，以及后期圖像處理和圖像定量分析都進(jìn)行了詳細(xì)的說明和討論。在多光譜熒光顯微內(nèi)鏡成像系統(tǒng)中使用Hamamatsu公司的sCOMS相機(jī)，可獲得最高200幀/秒1024×1024圖像，從而減少偽影對(duì)圖像質(zhì)量的影響。使用標(biāo)準(zhǔn)分辨率靶對(duì)MFE系統(tǒng)分辨率進(jìn)行了測(cè)試，基于不同規(guī)格的成像光纖，得到其分辨率最大為1.2微米

6、，可對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。使用標(biāo)準(zhǔn)視場靶對(duì)MFE系統(tǒng)視場大小進(jìn)行了測(cè)試，基于不同規(guī)格的成像光纖，得到其視場最大為600微米。根據(jù)臨床需要，選擇藤倉FIGH-30-650S作為默認(rèn)成像光纖，構(gòu)建了原理樣機(jī)。應(yīng)用MFE成像系統(tǒng)對(duì)比色卡及染料擦鏡紙進(jìn)行成像，所得圖像完整流暢，說明光纖束端面平整，沒有出現(xiàn)端面的損壞，可以滿足成像要求；對(duì)FITC標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)熒光小球進(jìn)行成像，說明MFE成像系統(tǒng)可以對(duì)不同熒光染料進(jìn)行成像；對(duì)植物葉片組織進(jìn)行成像，葉片

7、中不規(guī)則結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)中都得到很好的分辨，也說明MFE成像系統(tǒng)對(duì)這種尺寸的樣品具有很好的分辨能力。
　　選擇日本長耳兔進(jìn)行活體成像研究，對(duì)日本長耳兔正常食管、胃、小腸、大腸黏膜及肝臟組織進(jìn)行吖啶黃表面噴灑染色后，應(yīng)用MFE系統(tǒng)觀察。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同部位的正常胃腸道粘膜的MFE圖像特點(diǎn)，能夠正確區(qū)分食管、胃、小腸、大腸黏膜組織，成像結(jié)果與相應(yīng)部位病理結(jié)果具有很好的一致性，初步驗(yàn)證了通過MFE成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)胃腸道黏膜虛擬組織病理成像的可行

8、性。正常食管黏膜表現(xiàn)為細(xì)胞核呈分布規(guī)則的圓形亮點(diǎn)狀；正常齒狀線表現(xiàn)為條帶狀，兩側(cè)分別為食管鱗狀上皮和柱狀上皮，表現(xiàn)為類橢圓形或長形分枝狀；正常胃底黏膜（胃底腺）表現(xiàn)為胃小凹開口呈點(diǎn)狀或類橢圓形，腺體變現(xiàn)為頸短而細(xì)的單支管狀腺，周邊裂隙呈線樣；正常胃竇黏膜（幽門腺）表現(xiàn)為胃小凹開口呈線狀或裂隙狀，由多個(gè)彎曲的棒狀分支管狀腺共同組成一個(gè)胃小凹；正常小腸黏膜表現(xiàn)為絨毛呈寬大的指狀，呈簇狀排列；正常結(jié)腸黏膜表現(xiàn)為腺體大小一致，排列規(guī)律，腺體開口

9、呈圓形或橢圓形；正常肝臟組織表現(xiàn)為均勻分布的亮點(diǎn)狀，細(xì)胞核大小均一，排列規(guī)則，細(xì)胞核大小一致，布滿整個(gè)視野。將MFE成像結(jié)果與HRME成像結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MFE成像系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)多光譜成像的同時(shí)，圖像采集速度提高了6倍，圖像分辨率提升了4倍，運(yùn)動(dòng)偽影明顯減少，圖像質(zhì)量更佳。
　　應(yīng)用MFE成像系統(tǒng)對(duì)日本長耳兔正常胃腸道黏膜及肝臟組織進(jìn)行熒光素鈉在體成像，成像結(jié)果與相應(yīng)部位病理結(jié)果具有一致性。正常胃底黏膜表現(xiàn)為胃小凹開口為非連續(xù)的圓形

10、或卵石狀，排列規(guī)則；正常胃竇黏膜表現(xiàn)為胃小凹較深，胃小凹周圍腺體結(jié)構(gòu)呈短棒狀，呈條索樣或裂隙樣開口；正常小腸黏膜表現(xiàn)為絨毛呈指狀或?qū)捜~狀，熒光素鈉均勻分布于血管中，可見血液在血管中流動(dòng)；正常結(jié)腸黏膜表現(xiàn)為結(jié)腸隱窩呈圓形，大小一致，排列規(guī)則；正常肝臟組織表現(xiàn)為肝細(xì)胞依次連接排列組成肝板，MFE下表現(xiàn)為明亮條索狀結(jié)構(gòu)。將MFE成像結(jié)果與商用CLE成像結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示MFE系統(tǒng)圖像分辨率略低于CLE圖像，但MFE系統(tǒng)具有成像速度快，圖像

11、偽影少，多光譜成像，操作簡便，價(jià)格低等優(yōu)勢(shì)。
　　為了進(jìn)一步減少成像光纖產(chǎn)生的蜂窩狀噪聲，提高圖像質(zhì)量，我們嘗試使用二維高斯濾波算法及均值濾波算法處理正常食管鱗狀上皮與食管鱗狀細(xì)胞癌HRME圖像，來消除光纖本身的網(wǎng)格化噪聲。選取感興趣區(qū)域，并對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)行二值化處理后，計(jì)算圖像中細(xì)胞核輪廓的面積，正常鱗狀上皮細(xì)胞的平均核面積為（157.32±60.67）μm2，而鱗狀細(xì)胞癌的平均核面積為（583.4±146.4）μm2，對(duì)正常鱗

12、狀上皮及食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞核面積進(jìn)行t檢驗(yàn)，兩組細(xì)胞核面積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了多光譜熒光顯微內(nèi)鏡，具有多光譜成像、減少運(yùn)動(dòng)偽影、提高圖像質(zhì)量的優(yōu)勢(shì)，初步具備了與消化內(nèi)鏡結(jié)合的條件，更加適用于聯(lián)合分子影像學(xué)技術(shù)開展臨床應(yīng)用研究。
　　動(dòng)物活體成像研究表明，MFE成像系統(tǒng)能夠正確區(qū)分食管、胃、小腸、大腸黏膜組織，成像結(jié)果與病理結(jié)果具有很好的一致性，初步驗(yàn)證了通過MFE成像系