海水浮游病毒提取技術(shù)及其熒光顯微計(jì)數(shù)方法.pdf

1、海洋中病毒含量極其豐富，多種多樣，是海洋中最普通的生物群體，是海洋生物化學(xué)循環(huán)中最大的一環(huán)，在微生物食物環(huán)中有著重要的生態(tài)學(xué)意義，可以影響許多生物地球化學(xué)過(guò)程和生態(tài)學(xué)過(guò)程，海洋病毒能夠侵染多種海洋生物，是海洋中最主要的致命體，幾乎對(duì)所有的海洋生物都有所影響，眾所周知，由病毒引起的病毒性傳染疾病，給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大危害和損失，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中急待解決的一大難題。 盡管如此，直到近幾年，人們對(duì)海洋病毒的認(rèn)識(shí)仍然大大落后于其實(shí)

2、際存在。近十年來(lái)，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，Berghetal.(1989)、Suttleetal.(1990)、Fuhrman(1999)、Kirchman(1999)和Mannetal.(2003)等陸續(xù)在Nature上發(fā)表了多篇有關(guān)海洋病毒生態(tài)作用的報(bào)告，人們才逐漸意識(shí)到海洋病毒的生態(tài)意義。 因此，開(kāi)展對(duì)海洋游離病毒的基礎(chǔ)性研究，對(duì)不同海域的病毒進(jìn)行分離，建立我國(guó)不同海域的病毒分離物資源保存庫(kù)和病毒基因庫(kù)，將對(duì)海洋病毒生態(tài)學(xué)及流

3、行病學(xué)研究提供前提，對(duì)海洋生態(tài)動(dòng)力學(xué)的學(xué)科創(chuàng)新、海水養(yǎng)殖業(yè)病毒害防治和海水病毒的快速檢測(cè)鑒定具有重要意義。 本論文在農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題資助下，對(duì)海水中浮游病毒的存在及分布進(jìn)行了研究，初步建立了高效、快速、高通量提取純化海洋病毒的方法，對(duì)青島及附近海區(qū)的海水中浮游病毒做了熒光顯微計(jì)數(shù)定量，對(duì)濃縮分離后的病毒做了基因文庫(kù)構(gòu)建的初步研究。 為了從海水中提取純化病毒，本文對(duì)吸附洗脫法、化學(xué)絮凝法

4、等濃縮方法進(jìn)行了探索和嘗試，最后利用三氯化鋁沉淀病毒，同時(shí)加入滑石粉-硅藻土作為病毒吸附劑促進(jìn)病毒吸附沉淀的方法，初步建立起了一種可以通過(guò)處理大體積海水濃縮病毒的海水病毒提取方法，在青島近海海域的海水中成功提取到了游離的病毒。電鏡觀察的結(jié)果表明，海水中不僅存在著一定豐度的游離病毒，而且病毒的種類(lèi)多種多樣。病毒形態(tài)有具纖突的球狀病毒、不具纖突的球狀病毒和桿狀病毒、噬菌體等，病毒粒子大小在40nm～400nm之間。 酚抽提法提取濃縮

5、純化后的病毒的核酸，分別機(jī)械剪切和酶切，利用大腸桿菌DH-5α菌株嘗試構(gòu)建病毒的基因組文庫(kù)，經(jīng)α互補(bǔ)篩選獲得了呈現(xiàn)陽(yáng)性的菌株，但PCR和酶切初步分析鑒定的結(jié)果中未有外源基因片段插入。對(duì)提取純化的病毒做紅外吸收定量分析表明，病毒的濃度太低，對(duì)病毒核酸的酶切電泳分析表明，所獲得的混合病毒核酸型無(wú)法確定，需要建立病毒的有效篩選途徑，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同病毒的檢測(cè)和進(jìn)一步分離。 為了對(duì)海水中病毒的數(shù)量和分布有所了解，我們采用新型熒光核酸染料SY