K562細(xì)胞衍生的微泡對其自身作用的初步探索.pdf

1、目的:慢性髓細(xì)胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)是造血干細(xì)胞的惡性克隆增生性疾病,其發(fā)病率在我國列于白血病的第三位。雖然格列衛(wèi)等靶向藥物的應(yīng)用給慢粒的治療帶來了巨大突破,但無效耐藥復(fù)發(fā)仍然是當(dāng)前一大難題,需要我們從新的角度研究慢粒的發(fā)病機(jī)理。微泡(microvesicles,MVs)是從正?；蚰[瘤細(xì)胞膜表面脫落或內(nèi)體腔分泌的圓形膜片段,通過激活各種信號通路、促進(jìn)血管形成調(diào)節(jié)造血微環(huán)境促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。本實(shí)

2、驗主要研究慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞衍生的微泡對其自身增殖凋亡的影響及相關(guān)作用機(jī)制,為進(jìn)一步深入研究慢粒白血病細(xì)胞衍生的微泡對疾病發(fā)生發(fā)展的影響奠定基礎(chǔ)。
　　方法:無血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)K562細(xì)胞24小時后收集上清,2000g/m離心30分鐘,去除細(xì)胞與雜質(zhì),后以20000g離心2小時提取MVs,BCA法行蛋白定量;PKH26紅色熒光染料標(biāo)記K562-MVs后,與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在無血清RPMI

3、1640培養(yǎng)液中共同孵育10h,棄去培養(yǎng)上清,無菌PBS洗滌兩遍,加入新鮮培養(yǎng)液,熒光顯微鏡下觀察兩者融合情況并拍片;0、60、120、200、300、400μg/mlK562-MVs分別作用于K562細(xì)胞48h,CCK8法觀察細(xì)胞增殖情況;通過AnnexinV/PI雙染法流式細(xì)胞儀(FCM)檢測K562-MVs120μg/ml作用組細(xì)胞凋亡情況,并應(yīng)用SYBRGreenI熒光實(shí)時定量PCR檢測Bcl-2基因的表達(dá)變化。應(yīng)用SPSS17

4、.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所得數(shù)據(jù)以SDX±?表示,多個樣本的組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和SNK兩兩比較法,兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗法,P<0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡下觀察可見PKH26紅色熒光染料標(biāo)記的K562-MVs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)膜相融合,兩者結(jié)合緊密,經(jīng)PBS緩沖液洗滌后未分離。K562-MVs60μg/ml作用組細(xì)胞增殖輕微受抑,與對照組相比差異無顯著性(P>0.

5、05),120、200、300、400μg/ml作用組細(xì)胞增殖增加,促細(xì)胞增殖率分別為16.39±1.17％、33.50±1.44%、45.18±2.45%、59.52±6.92%,表現(xiàn)為濃度依賴性,隨著濃度的增加增殖率逐漸增加,各作用組與對照組之間及各作用組間差異具有顯著性(P<0.05﹚;120μg/mlK562-MVs作用于細(xì)胞48h后,與陰性對照組相比細(xì)胞凋亡率減低,兩組凋亡率分別為3.82±0.04%、5.17±0.05%,兩

6、組之間差異具有顯著性(P<0.05);而且實(shí)驗組Bcl-2基因的表達(dá)水平升高,約為對照組Bcl-2基因表達(dá)量的1.89倍,差異具有顯著性(P<0.05)。以上結(jié)果表明:K562-MVs裝載著大量促生長信號分子,通過與細(xì)胞膜相融合的方式傳遞給靶細(xì)胞,激活了相關(guān)信號通路,部分上調(diào)了抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平,發(fā)揮其促增殖抗凋亡作用。
　　結(jié)論:K562細(xì)胞衍生的MVs并非毫無意義的細(xì)胞碎片,而是具有生物活性的信息載體分子,可以通過