辛伐他汀對K562細(xì)胞作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：觀察辛伐他汀對K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討辛伐他汀抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的分子機(jī)制。 方法：1．不同濃度辛伐他汀處理K562細(xì)胞24h，48h，72h，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。2．聯(lián)合應(yīng)用AnnexinV．FITC／PI雙染法，光學(xué)顯微鏡和瓊脂糖凝膠電泳檢測辛伐他汀對K562細(xì)胞凋亡的影響，AnnexinV—FITC／PI雙染法檢測辛伐他汀聯(lián)合MIT對K562細(xì)胞凋亡的影響。辛伐他汀作用K562細(xì)胞24h

2、，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。3．辛伐他汀處理K562細(xì)胞48h，免疫組織化學(xué)法測定突變P53，PCNA蛋白表達(dá)。4．辛伐他汀作用K562細(xì)胞48h，72h，利用分光光度法和PCR-ELISA法分別測定caspase-3,-9活性和端粒酶活性。5．辛伐他汀作用K562細(xì)胞72h，采用RT-PCR測定c-myc，c-jun，Bcl-2，Bax，survivin，cyclinDl，E2F1，MAPKl，hTERT,p21，p27mRNA的表達(dá)，

3、同時(shí)采用熒光定量RT-PCR檢測hTERTmRNA的表達(dá)。6．采用基因芯片技術(shù)檢測辛伐他汀作用K562細(xì)胞后的基因表達(dá)變化。 結(jié)果：1．辛伐他汀能抑制K562細(xì)胞增殖，其作用具有濃度和時(shí)間依賴性。2．AnnexinV—FITC／PI雙染法檢測結(jié)果顯示，5gmol／L，10gmol／L，20pmol／L辛伐他汀作用K562細(xì)胞48h能誘導(dǎo)其凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為(4．00+0．13)％，(6．24+0．18)％和(9．41~0．2

4、2)％，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。5gmol／L，101amol／L，20gmol／L辛伐他汀作用K562細(xì)胞72h，細(xì)胞凋亡率分別為(7．62+0．21)％，(12．41+0．32)％和(19．08+0．26)％，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。10gmol／L，20gmol／L辛伐他汀作用K562細(xì)胞72h出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，包括核固縮、核碎裂和凋亡小體形成等，同時(shí)DN

5、A凝膠電泳可見典型的DNALadder。0．25gmol／LMIT作用K562細(xì)胞72h細(xì)胞凋亡率為(16．38+0．20)％，而10~tmol／L辛伐他汀聯(lián)合0．25gmol／LMIT作用K562細(xì)胞72h細(xì)胞凋亡率為(36．92+0．67)％，辛伐他汀能增強(qiáng)MIT誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡。辛伐他汀作用K562細(xì)胞24h，G0/G1期細(xì)胞百分比增加，而S期細(xì)胞百分比減少，細(xì)胞阻滯于G1／S期。3．免疫組化結(jié)果表明辛伐他汀能抑制突變P53

6、和PCNA蛋白的過度表達(dá)，10ytmol／L，20gmol／L辛伐他汀處理K562細(xì)胞48h，突變P53和PCNA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。4.10~tmol／L，20~tmol／L辛伐他汀作用K562細(xì)胞48h，72h，caspase-3，一9活性明顯升高，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。PCR-ELISA結(jié)果顯示辛伐他汀對K562細(xì)胞端粒酶活性存在一定的抑制作用

7、，10gmol／L，201~mol／L辛伐他汀作用K562細(xì)胞72h使端粒酶活性分別下降14．44％和25．87％。5．10~tmol／L，20gmol／L辛伐他汀處理K562細(xì)胞72h，c-myc，cyclinDl，MAPKl，E2F1，Bcl-2，hTERTmRNA表達(dá)水平明顯降低，p21，p27，c-junmRNA表達(dá)水平顯著升高，而對Bax，survivin表達(dá)無明顯影響。同時(shí)定量RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明辛伐他汀能下調(diào)hTER

8、TmRNA表達(dá)。6．基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)20gmol／L辛伐他汀作用K562細(xì)胞48h，312條基因表達(dá)上調(diào)，212條基因表達(dá)下調(diào)，其中包括15條未知基因表達(dá)改變。根據(jù)基因功能分為代謝相關(guān)、凋亡相關(guān)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)和細(xì)胞周期相關(guān)基因等。 結(jié)論：1．辛伐他汀能抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用具有濃度和時(shí)間依賴性。2．辛伐他汀可能通過下調(diào)c-myc，cyclinDl，E2F1，MAPKl，Bcl-2mRNA和突變P53，PCNA蛋

9、白表達(dá)，上調(diào)p21，p27，c-junmRNA表達(dá)使K562細(xì)胞阻滯于Gl／S期，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。3．辛伐他汀作用K562細(xì)胞引起hTERTmRNA表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而引起端粒酶活性下降。4．辛伐他汀可能通過激活caspase-9進(jìn)而活化caspase-3誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。5．辛伐他汀引起K562細(xì)胞312條基因表達(dá)上調(diào)，212條基因表達(dá)下調(diào)，其中包括15條未知基因表達(dá)改變。 6．本研究較系統(tǒng)地探討了辛伐他汀的抗慢性粒細(xì)