模式生物斑馬魚(yú)藥物依賴模型的建立以及中藥的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、背景
　　 目前，苯丙胺類中樞興奮劑(amphetamine-typestimulants，ATS)濫用增長(zhǎng)勢(shì)頭迅猛，世界五大洲21個(gè)國(guó)家的興奮劑濫用人數(shù)已超過(guò)海洛因和可卡因?yàn)E用人數(shù)之和，呈全球蔓延之勢(shì)。歐洲7個(gè)國(guó)家的一項(xiàng)調(diào)查表明，ATS已成為第二大類最常濫用的成癮物質(zhì)。在我國(guó)，苯丙胺類中樞興奮劑等新型毒品濫用形勢(shì)嚴(yán)峻，又因其嚴(yán)重?fù)p害中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等器官功能，易發(fā)生群體淫亂、人身攻擊等暴力，引起社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重

2、敗壞社會(huì)風(fēng)氣，因而研制針對(duì)其依賴及其戒斷癥狀的治療藥物意義深遠(yuǎn)。在我國(guó)中醫(yī)藥戒毒已經(jīng)有200多年歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，形成了一套特有的理論和方法。中醫(yī)藥戒毒以扶助正氣，排解煙毒為治療思想，突出辨證論治的特色。中藥療法具有低毒價(jià)廉、藥源廣泛、無(wú)成癮性等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，注重從病證出發(fā)，辨證施治，因此戒毒中藥很可能在戒毒問(wèn)題上取得突破性進(jìn)展。
　　 大量研究結(jié)果表明中樞谷氨酸神經(jīng)系統(tǒng)與藥物依賴有著密切的聯(lián)系，有關(guān)NMDA受體和AMPA受

3、體與藥物依賴的報(bào)道較多，而TH作為多巴胺合成的關(guān)鍵酶在藥物依賴形成過(guò)程中也起著十分重要的作用，但相關(guān)的報(bào)道不多。用綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)標(biāo)記TH是一種新的分子生物學(xué)技術(shù)，它使TH表達(dá)的變化變得更加直觀。GFP是一種能夠在活細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)光蛋白，不需要外源底物或輔助因子，在藍(lán)光的激發(fā)下能發(fā)出綠色熒光。GFP作為熒光標(biāo)記分子，既具有敏感的標(biāo)記檢測(cè)率，又沒(méi)有放射性的危害。
　　 條件性位

4、置偏愛(ài)(conditionedplacepreference，CPP)實(shí)驗(yàn)是一種通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)體驗(yàn)藥物效應(yīng)的位置是否產(chǎn)生偏愛(ài)，從而評(píng)價(jià)藥物精神依賴性潛力的有效方法。目前關(guān)于藥物精神依賴的研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，多集中嚙齒類的大鼠、小鼠等，而隨著越來(lái)越多樣化的毒品的出現(xiàn)，我們需要尋找新的可用的模式生物作為傳統(tǒng)模式生物的補(bǔ)充，應(yīng)用于成癮醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
　　 斑馬魚(yú)作為一種新型模式動(dòng)物，與大鼠、小鼠等哺乳動(dòng)物相比，由于其交配行為受光周期控制、

5、產(chǎn)卵量多、受精卵在體外受精、繁殖周期快、易于飼養(yǎng);而且前期胚胎整體透明，易于活體觀察等優(yōu)點(diǎn)，斑馬魚(yú)在行為學(xué)中的應(yīng)用前景逐漸被研究者所認(rèn)識(shí)。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　 1.擬建立成年斑馬魚(yú)的甲基苯丙胺CPP動(dòng)物模型，觀察成年斑馬魚(yú)CPP效應(yīng)，從行為學(xué)方面來(lái)評(píng)估成年斑馬魚(yú)的依賴效果，同時(shí)用中藥有效成分進(jìn)行干預(yù)，觀察形成依賴后成年斑馬魚(yú)的行為變化。
　　 2.采用蛋白免疫印跡(Westernblotting)方法，觀察甲基

6、苯丙胺條件性位置偏愛(ài)成年斑馬魚(yú)腦內(nèi)NR2B受體、GluR2受體和TH受體表達(dá)的改變及中藥活性成分鉤藤總堿對(duì)其干預(yù)后是否發(fā)生變化。
　　 3.用GFP來(lái)標(biāo)記多巴胺合成的關(guān)鍵酶—TH，然后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出TH—GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，通過(guò)觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部熒光的強(qiáng)弱來(lái)判斷其甲基苯丙胺依賴程度，同時(shí)初步摸索對(duì)于斑馬魚(yú)幼魚(yú)大葉鉤藤水提物的有效濃度。
　　 4.證實(shí)斑馬魚(yú)是一個(gè)研究苯丙胺類興奮劑依賴的理想模型和進(jìn)一步研究斑馬

7、魚(yú)的甲基苯丙胺依賴的作用機(jī)理以及中藥對(duì)其的干預(yù)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.成年斑馬魚(yú)條件性位置偏愛(ài)模型的建立:根據(jù)文獻(xiàn)以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知成年斑馬魚(yú)的天然偏愛(ài)箱為褐色箱，故選擇透明箱作為伴藥箱。給藥前用動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)成年斑馬魚(yú)進(jìn)行位置偏愛(ài)測(cè)定，剔除不符合天然偏愛(ài)習(xí)慣的動(dòng)物。測(cè)定前將實(shí)驗(yàn)箱中間隔板抽出，當(dāng)成年斑馬魚(yú)處于兩個(gè)箱體之間時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，逐條觀察15min，以成年斑馬魚(yú)頭部為準(zhǔn)，記錄成年斑馬魚(yú)

8、在白箱中的停留時(shí)間。取經(jīng)過(guò)自然位置偏愛(ài)測(cè)定合格的成年斑馬魚(yú)20條，按隨機(jī)分組原則分為:①正常對(duì)照組，②甲基苯丙胺模型組。d1將斑馬魚(yú)置于獨(dú)立的用于訓(xùn)練的CPP箱，每個(gè)CPP箱的水位不低于5cm，以保證足夠的水壓，適應(yīng)性喂養(yǎng)至少2d。于d3測(cè)試正常狀態(tài)下，所有斑馬魚(yú)的位置偏愛(ài)箱（15min內(nèi)），并且用Noldus動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)來(lái)跟蹤其路線圖（5min內(nèi)）。d4、d6、d8，將甲基苯丙胺模型組斑馬魚(yú)用tricaine麻醉后，置于柔軟粗糙

9、面上，用微量注射器，迅速腹腔注射甲基苯丙胺(40μg/g)，將其置于伴藥箱45min，伴藥箱與偏愛(ài)箱之間用一個(gè)透明擋板隔開(kāi)，使魚(yú)不能游過(guò)去，但又不會(huì)遮擋其視線。45min后，將魚(yú)移至較大的有藍(lán)色環(huán)境的魚(yú)缸，并且用70％的乙醇清潔CPP箱，最后用系統(tǒng)水沖洗?？瞻捉M注射等體積魚(yú)用生理鹽水，其他處理與模型組一致。d5、d7，在與d4注射的同一時(shí)間，斑馬魚(yú)用相同方法注射等體積的魚(yú)用生理鹽水，按相同的步驟，對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行訓(xùn)練。最后一次注射24h后(

10、即d9)，測(cè)試所有斑馬魚(yú)的伴藥箱停留時(shí)間以及在魚(yú)缸的路線圖，比較它們?cè)诎樗幭淝昂笸Ａ魰r(shí)間的差值。
　　 2.鉤藤總堿對(duì)甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚(yú)的影響:
　　 2.1鉤藤總堿對(duì)甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚(yú)CPP的影響:取經(jīng)過(guò)自然位置偏愛(ài)測(cè)定合格的成年斑馬魚(yú)50條，按隨機(jī)分組原則分為:①正常對(duì)照組，②甲基苯丙胺模型組，③模型+鉤藤總堿低劑量組(50μg/g)，④模型+鉤藤總堿高劑量組(100μg/g)，⑤模型+氯胺酮組(150μ

11、g/g)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行9d，d1將斑馬魚(yú)置于獨(dú)立的用于訓(xùn)練的CPP箱，每個(gè)CPP箱的水位不低于5cm，以保證足夠的水壓，適應(yīng)性喂養(yǎng)至少2d。d3測(cè)試正常狀態(tài)下，所有斑馬魚(yú)的位置偏愛(ài)箱（15min內(nèi)），并且用Noldus動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)來(lái)跟蹤其路線圖（5min內(nèi)）。在d4、d6、d8，將除開(kāi)空白組以外的所有斑馬魚(yú)浸入200mg/Ltricainemethanesulfonate溶液中麻醉，用微量注射器迅速腹腔注射甲基苯丙胺(40μg

12、/g)，然后將其置于非偏愛(ài)箱（伴藥箱）45min。之后的訓(xùn)練步驟與建立模型的訓(xùn)練步驟相同。12h后，將除開(kāi)空白組以外的所有斑馬魚(yú)再次浸入200mg/Ltricainemethanesulfonate溶液中麻醉，用微量注射器迅速腹腔注射相應(yīng)的處理藥物（模型組注射等體積生理鹽水，低劑量組注射50μg/g鉤藤總堿溶液，高劑量組注射100μg/g鉤藤總堿溶液，氯胺酮組注射150μg/g氯胺酮溶液），之后將其移至較大的有藍(lán)色環(huán)境的魚(yú)缸?？瞻捉M斑馬

13、魚(yú)用200mg/Ltricainemethanesulfonate溶液麻醉后注射等體積魚(yú)用生理鹽水，其他處理與模型組一致。d5和d7在與d4注射的同一時(shí)間，給予斑馬魚(yú)注射等體積的魚(yú)用生理鹽水，然后將其置于偏愛(ài)箱（非伴藥箱）45min。按上述相同的步驟，對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行訓(xùn)練。最后一次注射24h后(即d9)，測(cè)試所有斑馬魚(yú)的伴藥箱停留時(shí)間以及在魚(yú)缸的路線圖，比較它們?cè)诎樗幭淝昂笸Ａ魰r(shí)間的差值。
　　 2.2鉤藤總堿對(duì)甲基苯丙胺依賴成年斑

14、馬魚(yú)腦內(nèi)NR2B、GluR2和TH表達(dá)的影響:完成CPP測(cè)定后，將成年斑馬魚(yú)冷凍處死，取腦。將取出的腦，放入EP管中，加入適量的LysisBuffer，冰浴勻漿。之后于其后于4℃，14000rpm離心10min，取其上清液。每組取上清液2μl，將其稀釋20倍，從稀釋液中取5μl至96孔板，每組取3次，共15μl。然后，在96孔板每孔中加入ProteinAssayReagentA25μl、ProteinAssayReagentB200μl

15、。避光，緩慢振搖30min后，測(cè)蛋白濃度，放至-80℃凍存。配制好實(shí)驗(yàn)所需的溶液，待用。配制凝膠:一、分離膠，取10ml塑料離心管一支，分別加入MilliQ2.85ml、1.0MTris-HCl(PH=8.8)3ml、30％Acrylamide2.15ml、10％SDS40μl、10％APS40μl，灌膠前加入TEMED8μl，混勻，灌膠。二、濃縮膠，取10ml塑料離心管一支，分別加入MilliQ2.1ml、1.0MTris-HCl(P

16、H=6.8)0.375ml、30％Acrylamide0.375ml、10％SDS15μl、10％APS22.5μl，待分離膠凝好后，加入TEMED4.5μl，混勻，灌膠。SDS-PAGE電泳:將電泳槽加入足夠電泳液后，準(zhǔn)備上樣。每組蛋白按30μg上樣，兩端，分別上MagicMark和DualMark。前40min，以40V，130mA電泳。40min之后，DualMark會(huì)逐漸分開(kāi)，將電壓加大，以70V，130mA電泳。轉(zhuǎn)膜:在電泳結(jié)

17、束前約5min，配制好TransferBuffer。剪一張與分離膠差不多大小的PVDF膜，剪去一角，用100％甲醇浸潤(rùn)。取2塊MiniTransBlotFilterpaper，與浸潤(rùn)好的PVDF膜一起放入TransferBuffer中。電泳結(jié)束后，將濃縮膠與分離膠小心剝離，然后將分離膠輕輕取出，放入TransferBuffer中。從下至上，按照夾子黑色面—Filterpaper—分離膠—PVDF膜—Filterpaper—夾子紅色面的順

18、序做好“三明治”。將“三明治”放入轉(zhuǎn)移槽中，加入足夠的TransferBuffer，以15V，110mA，室溫，攪拌，電轉(zhuǎn)過(guò)夜。一抗、二抗的孵育:取出已轉(zhuǎn)好的PVDF膜，室溫下，在搖床上用1×TBST洗3次，每次10min，之后再用1×TBS洗10min。洗完后，用5％的脫脂牛奶在搖床上封閉1h。將封閉好的PVDF膜正面向上，涂上稀釋成適當(dāng)濃度的一抗，室溫下靜置2h。2h后，取出PVDF膜，于室溫下，在搖床上用1×TBST洗3次，每次5

19、min，之后再用1×TBS洗5min。將洗好的PVDF膜正面向上，涂上稀釋成適當(dāng)濃度的二抗，室溫下靜置1h。按照洗一抗的方法，洗去二抗。顯影、定影:在最后一遍洗滌時(shí)，準(zhǔn)備好ECL發(fā)光液，將其置于保鮮膜上，將洗好的PVDF膜，慢慢地蓋上（確保沒(méi)有氣泡），包好，放入X—光片夾。在暗室中，將1×的顯影液和定影液分別倒入塑料托盤中，在紅燈下取出X—光片，并剪成合適大?。ū萈VDF膜略大）。打開(kāi)X—光片夾，將剪好的X—光片覆蓋在PVDF膜上，合上

20、X—光片夾，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)調(diào)整曝光時(shí)間。拿出曝光好的X—光片，浸入顯影液中，直到出現(xiàn)明顯條帶后，取出，用清水漂洗后，放入定影液2-5min，取出再用清水清洗。掃描特異條帶，用Metamorph軟件分析每個(gè)特異條帶的OD值。
　　 3.斑馬魚(yú)幼魚(yú)藥物依賴模型的建立以及給藥劑量的初步探索:選取10對(duì)繁殖正常的成年斑馬魚(yú)，于繁殖前一天晚上分別放入10個(gè)繁殖缸中，雄魚(yú)和雌魚(yú)中間用透明隔板分開(kāi)，過(guò)夜。第二天上午，做好顯微注射的準(zhǔn)備之后，抽

21、開(kāi)中間隔板，迅速向卵黃囊中注射TH—GFP質(zhì)粒。然后，將注射完的魚(yú)卵，放入恒溫恒濕箱。12小時(shí)后，將普通eggwater換成含PTU的eggwater。5天后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察是否轉(zhuǎn)基因成功。顯微注射后第五天，取轉(zhuǎn)基因成功并且已經(jīng)能自由游動(dòng)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)12條，按隨機(jī)分組原則分為:①甲基苯丙胺（60mg/L）模型組，②甲基苯丙胺(6mg/L)模型組，③甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組，④甲基苯丙胺(0.06mg/L)模型組。將

22、每組斑馬魚(yú)幼魚(yú)放入相應(yīng)濃度的甲基苯丙胺溶液中自由游動(dòng)，禁食。3天后，取出。用PBST漂洗5min后，再用4％PFA固定，過(guò)夜。第二天，取出固定好的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，用PBST漂洗3次，每次5min。然后將固定好的斑馬魚(yú)幼魚(yú)放入液態(tài)的低熔點(diǎn)瓊脂糖中，調(diào)整好位置，待其凝固后，用熒光體視顯微鏡觀察其熒光變化。
　　 濃度摸索:顯微注射后第五天，取轉(zhuǎn)基因成功并且已經(jīng)能自由游動(dòng)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)21條，按隨機(jī)分組原則分為:①大葉鉤藤水提物(1g/mL

23、)組，②大葉鉤藤水提物（0.33g/mL）組，③大葉鉤藤水提物（0.033g/mL）組，④大葉鉤藤水提物（0.0033g/mL）組，⑤大葉鉤藤水提物（0.00033g/mL）組，⑥甲基苯丙胺（0.6mg/L）模型組，⑦空白對(duì)照組。除第⑦組外，將每組斑馬魚(yú)幼魚(yú)放入0.6mg/L的甲基苯丙胺溶液中自由游動(dòng)，禁食。3天后，將第①組—第⑤組的斑馬魚(yú)幼魚(yú)取出，放入相應(yīng)濃度的大葉鉤藤水提物中，第⑥組放入清水中，自由游動(dòng)。24h后，將所有斑馬魚(yú)幼魚(yú)取

24、出，用PBST漂洗5min后，再用4％PFA固定，過(guò)夜。第二天，取出固定好的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，用PBST漂洗3次，每次5min。然后將固定好的斑馬魚(yú)幼魚(yú)放入液態(tài)的低熔點(diǎn)瓊脂糖中，調(diào)整好位置，待其凝固后，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察其熒光變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，空自對(duì)照組成年斑馬魚(yú)和甲基苯丙胺模型組成年斑馬魚(yú)在非偏愛(ài)箱前后停留時(shí)間的差值，通過(guò)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(P=0.000)，表明兩組成年斑馬魚(yú)在非偏

25、愛(ài)箱前后停留時(shí)間的差值之間有顯著性差異。斑馬魚(yú)在魚(yú)缸的路線圖顯示，造模后，空白組造模前后的活動(dòng)路線變化不顯著，而甲基苯丙胺模型組斑馬魚(yú)在偏愛(ài)箱活動(dòng)的活動(dòng)軌跡與造模前相比，有明顯減少。
　　 2.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出:模型組訓(xùn)練前后在伴藥箱停留時(shí)間差與空白組訓(xùn)練前后在伴藥箱停留時(shí)間差相比，有顯著性差異(P=0.000)，表明成年斑馬魚(yú)條件性位置偏愛(ài)模型建立成功。與模型組訓(xùn)練前后在伴藥箱停留時(shí)間差相比，鉤藤總堿高劑量組(P=0.000

26、)和氯胺酮組(P=0.000)訓(xùn)練前后在伴藥箱停留時(shí)間差有顯著性差異，而鉤藤總堿低劑量組訓(xùn)練前后在伴藥箱停留時(shí)間差無(wú)明顯差別(P=0.949)。
　　 以適當(dāng)比例稀釋抗體進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)標(biāo)。與空白組成年斑馬魚(yú)相比，模型組成年斑馬魚(yú)腦內(nèi)的TH表達(dá)有顯著性差異(P=0.001)，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚(yú)(P=0.777)和氯胺酮組成年斑馬魚(yú)(P=0.546)腦內(nèi)的TH表達(dá)無(wú)顯著差異，與甲

27、基苯丙胺模型組成年斑馬魚(yú)相比，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚(yú)（P=0.001）和氯胺酮組成年斑馬魚(yú)(P=0.007)腦內(nèi)的TH表達(dá)有顯著差異，鉤藤總堿低劑量組成年斑馬魚(yú)腦內(nèi)的TH表達(dá)無(wú)顯著性差異(P=0.113)，與空白組成年斑馬魚(yú)相比，模型組成年斑馬魚(yú)(P=0.001)和鉤藤總堿低劑量組成年斑馬魚(yú)(P=0.01)腦內(nèi)的NR2B表達(dá)有顯著性差異，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚(yú)（P=0.083）和氯胺酮組成年斑馬魚(yú)(P=0.105)腦內(nèi)的NR2B

28、表達(dá)無(wú)顯著差異，與空白組成年斑馬魚(yú)相比，模型組成年斑馬魚(yú)腦內(nèi)的GluR2表達(dá)有顯著性差異(P=0.04)，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚(yú)（P=0.334）和氯胺酮組成年斑馬魚(yú)（P=0.130）腦內(nèi)的GluR2表達(dá)無(wú)顯著差異，與甲基苯丙胺模型組成年斑馬魚(yú)相比，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚(yú)腦內(nèi)的GluR2表達(dá)有顯著差異（P=0.003），鉤藤總堿低劑量組成年斑馬魚(yú)腦內(nèi)的GluR2表達(dá)無(wú)顯著性差異(P=0.698)。
　　 3.轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯

29、示，與正常斑馬魚(yú)幼魚(yú)相比，顯微注射TH—GFP質(zhì)粒后的斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部出現(xiàn)明顯熒光。在綠色熒光下，與空白組斑馬魚(yú)幼魚(yú)相比，甲基苯丙胺(60mg/L)模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部熒光變化明顯，甲基苯丙胺(6mg/L)模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部熒光變化明顯，甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部熒光變化明顯，而甲基苯丙胺(0.06mg/L)模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部熒光變化則不明顯。將大葉鉤藤水提物(1g/mL)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)，大葉鉤藤水提物(0.33g

30、/mL)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)，大葉鉤藤水提物（0.033g/mL）組斑馬魚(yú)幼魚(yú)，大葉鉤藤水提物(0.0033g/mL)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)，大葉鉤藤水提物（0.00033g/mL）組斑馬魚(yú)幼魚(yú)放入相應(yīng)濃度的水提物中24h后，大葉鉤藤水提物(1g/mL)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)，大葉鉤藤水提物(0.33g/mL)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)，大葉鉤藤水提物（0.033g/mL）組斑馬魚(yú)幼魚(yú)和大葉鉤藤水提物（0.0033g/mL）組斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡，大葉鉤藤水提物(0.00033g/m

31、L)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)游動(dòng)正常。在共聚焦顯微鏡下，與空白組相比，甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部熒光明顯增強(qiáng)。與甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組相比，大葉鉤藤水提物(0.00033g/mL)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部熒光有所減弱。
　　 結(jié)論
　　 1.甲基苯丙胺可以使成年斑馬魚(yú)產(chǎn)生明顯的位置偏愛(ài)效應(yīng)，成年斑馬魚(yú)在伴藥箱中停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，證明成年斑馬魚(yú)可以作為模式生物進(jìn)行藥物依賴方面的研究。高劑量鉤藤總堿(100μg

32、/g)和氯胺酮(150μg/g)可顯著抑制甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚(yú)的位置偏愛(ài)效應(yīng)，使之與甲基苯丙胺模型組成年斑馬魚(yú)有顯著差異。而低劑量鉤藤總堿(50μg/g)對(duì)甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚(yú)的位置偏愛(ài)效應(yīng)沒(méi)有顯示出明顯的抑制效果。
　　 2.甲基苯丙胺依賴的形成會(huì)使正常成年斑馬魚(yú)腦內(nèi)TH、NR2B、GluR2三種蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。高劑量鉤藤總堿(100μg/g)和氯胺酮(150μg/g)可顯著抑制這種改變，使甲基苯丙胺依賴的成年斑馬魚(yú)

33、腦內(nèi)的TH、NR2B、GluR2三種蛋白表達(dá)下調(diào)，而低劑量鉤藤總堿(50μg/g)對(duì)這種改變沒(méi)有明顯作用。
　　 3.可以利用TH—GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，在顯微鏡下通過(guò)綠色熒光強(qiáng)弱來(lái)直觀的觀察斑馬魚(yú)甲基苯丙胺依賴情況，以及藥物對(duì)其的干預(yù)效果:0.6mg/L的甲基苯丙胺溶液就能使TH—GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)頭部熒光發(fā)生明顯增強(qiáng)，而濃度為0.00033g/mL大葉鉤藤水提物可以降低這種熒光的改變。
　　 注:本論文中的所有數(shù)據(jù)均采

34、用SPSS13.0進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以((x)±SD)表示，各組成年斑馬魚(yú)在伴藥箱中的停留時(shí)間比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)或者協(xié)方差分析(analysisofcovarinance，ANCOVA)，各組均數(shù)的多重比較采用最小顯著差值法(leastsignificantdifferent，LSD)，不滿足方差齊性要求的，采用Dunnett'sT3法。Westernblotting結(jié)果以每張轉(zhuǎn)印膜上目的蛋白條帶光密度值，