新型斑馬魚模型在研究腫瘤浸潤、轉移和血管侵襲機制中的應用.pdf

1、第一部分新型斑馬魚腫瘤模型的建立及巨噬細胞介導的腫瘤轉移機制的
　　研究背景:
　　現(xiàn)在在世界范圍內惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率越來越高，而轉移常常是造成癌癥病人死亡的主要原因。是什么造成了腫瘤的轉移？越來越多的證據(jù)指向了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境是一個復雜的由多種細胞和結構成分混合而成的綜合體，包括腫瘤細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、周細胞等，腫瘤微環(huán)境可以為癌癥的生長和轉移提供支持。在各種被募集的細胞中，巨噬細胞存在于

2、腫瘤進展的各個階段而且數(shù)量巨大。一般情況下，巨噬細胞被認為是可以吞噬異物，殺滅腫瘤細胞的，起到清道夫的作用，但是在許多臨床和基礎研究中卻發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞起到了促進腫瘤生長和轉移的作用。在原發(fā)腫瘤中，巨噬細胞可以誘導新生血管生成，促進腫瘤細胞的侵襲、遷移以及破壞血管進入血液循環(huán)，在腫瘤轉移的過程中，巨噬細胞可以促進腫瘤細胞在轉移部位的定植和生存。巨噬細胞有很多亞型，最常用的分型就是M1和M2，M1又叫做經典途徑激活的巨噬細胞，與Th1輔助T

3、細胞對病原體的反應有關，M2又叫做旁路途徑激活的巨噬細胞，與Th2輔助T細胞有關。有研究認為，腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞已經由M1亞型轉變?yōu)镸2亞型。盡管許多研究認為腫瘤相關巨噬細胞能夠促進腫瘤的轉移，但這仍然存在爭議。目前研究腫瘤轉移的模型主要為小鼠模型，通常只能觀察腫瘤發(fā)展終末期發(fā)生轉移的情況，但臨床實際情況是許多癌癥因為轉移灶才明確了診斷，而那時原發(fā)腫瘤仍然很小甚至無法探測。所以如何研究腫瘤發(fā)生早期出現(xiàn)轉移的機制仍需要一種新的動物模

4、型。
　　由于斑馬魚基因與人類基因的相似度達到了87％，而且具有繁殖快、花費較少、實驗周期短等優(yōu)勢，最近幾十年在生物科學領域得到了廣泛的應用。早在上世紀六十年代，斑馬魚就開始被用做發(fā)育遺傳學中的動物模型，而直到1982年，有研究發(fā)現(xiàn)長期暴露在致癌物質下的斑馬魚長出了腫瘤，斑馬魚才開始被用作腫瘤模型。相比與小鼠腫瘤模型，斑馬魚模型有兩個主要的優(yōu)勢，首先，斑馬魚不受動物數(shù)量的限制，每個實驗組可以使用成百上千的胚胎，而小鼠如果每組超過1

5、0只就會耗費大量的精力和財力;其次，在小鼠中如果要對移植的腫瘤細胞顯像，一般使用熒光蛋白或者生物發(fā)光，分辨率較低，而在透明的斑馬魚中則可以使用高分辨率熒光共聚焦顯微鏡對單細胞進行顯像。我們在此前的一項研究中將熒光染料標記的腫瘤細胞植入到斑馬魚的卵周隙中，建立了一種新的腫瘤模型，斑馬魚胚胎透明的特性使我們可以從單細胞水平對腫瘤的生長和轉移進行體內顯像，結果發(fā)現(xiàn)組織缺氧可以明顯的促進腫瘤細胞的轉移。而在本研究中，我們試圖通過引入腫瘤微環(huán)境中

6、不同的細胞成分來建立一種全新的斑馬魚模型。
　　目的:
　　本研究旨在使用斑馬魚胚胎建立腫瘤細胞與巨噬細胞相互作用的腫瘤微環(huán)境的模型，然后使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察腫瘤細胞的轉移特性以及腫瘤細胞與其他細胞（例如巨噬細胞、內皮細胞）之間的關系。并結合臨床標本對腫瘤轉移的機制進行探討，研究多種不同的細胞因子刺激對巨噬細胞性質變化的影響，評價不同的巨噬細胞亞型對腫瘤生長和轉移的作用。
　　方法:
　　1.使用

7、不同的細胞因子（IL6、TNFα、TG邛、IL4、IL10、LPS、IFNγ）體外刺激小鼠或者人的巨噬細胞，得到不同的巨噬細胞亞型M1和M2。
　　2.使用磁珠分選從小鼠或人的腫瘤組織中直接得到腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）。
　　3.將不同顏色的熒光染料標記的腫瘤細胞單獨或者和巨噬細胞一起注射到受精后48h的轉基因FLi1∶EGFP斑馬魚胚胎的卵周隙中，建立腫瘤微環(huán)境模型。
　　4.使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡在單細胞

8、水平動態(tài)觀察腫瘤細胞、巨噬細胞和內皮細胞之間的相互作用，以及腫瘤細胞的侵襲和轉移情況。
　　結果:
　　1.成功建立了不同顏色的腫瘤細胞和巨噬細胞共存的腫瘤微環(huán)境模型。
　　2.使用IL6和TNFα體外刺激的巨噬細胞或者從高表達IL6和TNFα的腫瘤中分離出的巨噬細胞可以明顯促進腫瘤細胞的轉移，而且大部分腫瘤細胞都跟巨噬細胞耦合在一起轉移。從野生型LLC腫瘤中分離出的巨噬細胞只能微弱地促進腫瘤細胞地轉移，而對照組使用P

9、BS進行刺激的巨噬細胞并不能促進腫瘤細胞的轉移。
　　3.使用TGFβ、IL4和IL10共同刺激得到的或者從小鼠腫瘤組織中分離得到的M2亞型的巨噬細胞顯著的促進腫瘤細胞的轉移，大部分轉移的腫瘤細胞都伴隨著巨噬細胞。而使用LPS和IFNγ共同刺激得到的或者從小鼠腫瘤組織中分離得到的M1亞型的巨噬細胞沒有表現(xiàn)出促進腫瘤細胞轉移的特性。
　　4.從出現(xiàn)轉移的臨床病人新鮮腫瘤組織中分離出的腫瘤相關巨噬細胞在斑馬魚模型中能夠明顯促進腫

10、瘤細胞的轉移，而從沒有出現(xiàn)轉移的臨床腫瘤標本中分離出的巨噬細胞只能夠微弱地促進腫瘤細胞的轉移。
　　結論:
　　1.成功建立了腫瘤細胞、巨噬細胞與血管內皮細胞三種細胞相互作用的腫瘤微環(huán)境模型，并可使用多種顏色進行體內顯像。
　　2.IL6和TNFα的體外刺激或者體內作用都可以改變巨噬細胞的性質，使其促進腫瘤轉移。
　　3.體外刺激或者是從腫瘤組織分離得到的M2亞型的巨噬細胞可以促進腫瘤轉移，而M1亞型的巨噬細胞沒

11、有表現(xiàn)出這種能力。
　　4.腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)促進腫瘤細胞轉移的能力與其對應臨床病人所患腫瘤是否出現(xiàn)轉移相關聯(lián)，腫瘤的轉移需要通過TAMs的介導來實現(xiàn)。
　　第二部分斑馬魚原位腫瘤模型的建立及視網膜母細胞瘤侵襲和轉移機制的實驗研究
　　研究背景:
　　視網膜母細胞瘤是兒童當中最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在眼內腫瘤居于首位，常見于視網膜核層，有家族遺傳性，多發(fā)生于5歲以下兒童，可單眼、雙眼先后或同時患病，

12、極易發(fā)生轉移，最常見的轉移途徑是從眼球的后極部開始，沿視神經入腦并向眼外蔓延，惡性程度高，死亡率高，因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療是提高生存率和降低死亡率的關鍵。手術治療是目前主要的治療手段，其他治療手段還包括化學治療、放射治療、冷凍治療、光凝治療等。
　　視網膜母細胞瘤的發(fā)病原因是Rb抑癌基因的全部兩個等位基因失活導致了其抑癌功能的缺失，它是一種具有高度的遺傳傾向的惡性腫瘤，大約40％的病人為常染色體顯性遺傳，Rb基因攜帶者的后代大

13、約有50％的幾率發(fā)病。最近，視網膜母細胞瘤作為遺傳性的腫瘤模型，越來越受到研究者們的重視。最初研究者們是將分離培養(yǎng)的視網膜母細胞瘤細胞系例如Y79細胞注射到免疫缺陷小鼠的皮下成為移植瘤模型，或者是將腫瘤細胞注射到大鼠眼睛的玻璃體腔里建立原位瘤模型。此后，隨著轉基因技術的迅速發(fā)展，大量的轉基因視網膜母細胞瘤小鼠模型被應用到基礎研究中，例如人為的使癌基因SV40-T抗原過表達建立了LHBETATAG視網膜母細胞瘤模型，多種轉基因小鼠模型的出

14、現(xiàn)為研究視網膜母細胞瘤的發(fā)生機制以及新型抗腫藥物的評價提供了便利，但是如何重現(xiàn)視網膜母細胞瘤多發(fā)于兒童的實際情況，如何在顯微水平研究視網膜母細胞瘤發(fā)生早期生長和轉移的機制尚缺乏理想的動物模型。
　　目的:
　　本研究旨在使用斑馬魚胚胎建立視網膜母細胞瘤的原位癌模型，然后使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡在單細胞水平動態(tài)地觀察腫瘤細胞的侵襲轉移以及腫瘤細胞與血管之間的關系，并研究抗血管藥物或者嗎啉基對視網膜母細胞瘤生長和轉移的影響。

15、
　　方法:
　　1.將不同的視網膜母細胞瘤細胞系注射到Fli1∶EGFP轉基因斑馬魚胚胎眼球中的玻璃體腔，建立原位腫瘤模型。
　　2.使用抗血管藥物舒尼替尼或者抑制腫瘤血管生長因子的嗎啉基作用于斑馬魚胚胎，然后在不同的時間點使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察腫瘤細胞的侵襲和轉移情況以及腫瘤細胞和血管內皮細胞之間的相互作用。
　　結果:
　　1.成功建立了視網膜母細胞瘤的斑馬魚原位腫瘤模型。
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