基于高通量測(cè)序技術(shù)的microRNA文庫(kù)制備研究及在子癇病人測(cè)序中的應(yīng)用.pdf

1、ResearchesofmicroRNAlibrarybasedonhighthroughputsequencingtechnologyanditsapplicationformicroRNAsequencinginpatientswithpreeclampsiaADissertationSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofEngineeringBYJi

2、afengLuSupervisedbyProfessorZuhongLuDepartmentofBiologyScienceandMedicalEngineeringSoutheastUniversityMay2010摘要摘要論文題目：基于高通量測(cè)序的microRNA文庫(kù)制備研究及在子癇病人測(cè)序中的應(yīng)用研究生姓名：陸嘉逢導(dǎo)師姓名：陸祖宏教授學(xué)校名稱：東南大學(xué)越來(lái)越多的科學(xué)研究以及個(gè)體化醫(yī)療需要發(fā)展新一代的更廉價(jià)、更快速的DNA測(cè)序技術(shù)。

3、第二代測(cè)序技術(shù)是目前使用最廣泛、最成熟的高通量測(cè)序技術(shù)，從可靠性和準(zhǔn)確性上得到了充分的證實(shí)。研究表明microRNA參與了一系列的重要的生理過(guò)程，microRNA研究已經(jīng)成為生物領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。但是目前檢測(cè)非編碼／J、RNA的主要手段是基于生物芯片或者熒光定量PCR，芯片的方法結(jié)果是半定量的，不能區(qū)分高度類似的microRNA；而熒光定量PCR檢測(cè)大樣本量的microRNA時(shí)，顯得非常繁瑣。高通量測(cè)序非常適合于小分子RNA或非編碼RN

4、A(ncRNA)的研究，能較好地解決芯片技術(shù)在檢測(cè)小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題(短序列，高度同源)，而且小分子RNA正好配合了高通量測(cè)序的長(zhǎng)度，同時(shí)測(cè)序的方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。本文圍繞第二代測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行了血漿microRNA提取研究、microRNAi貝1]序文庫(kù)制備的工作。在此基礎(chǔ)之上使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)先兆子癇病人胎盤和血漿的microRNA進(jìn)行研究。本文主要工作如下：一、血漿microRNA提取研究作為在血漿中含量非常

5、稀少的小分子核酸，血漿microRNA的特性還不被知曉。既往實(shí)驗(yàn)為了提取到合格質(zhì)量的microRNA，往往使用大樣本的血漿，結(jié)果也常常很不穩(wěn)定。而第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)提取的血漿microRNA的質(zhì)量有較高的要求。我們綜合比較了傳統(tǒng)TRIZOL法和玻璃纖維柱法提取的血漿microRNA的質(zhì)量，認(rèn)為使用玻璃纖維柱提取血漿microRNA是更為可靠的方法，從而為構(gòu)建高質(zhì)量的microRNA測(cè)序文庫(kù)制備打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，我們還研究了血漿m

6、icroRNA的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)血漿microRNA在煮沸、反復(fù)凍融，甚至RNase酶的作用下均能保持相當(dāng)強(qiáng)的穩(wěn)定性。二、microRNA測(cè)序文庫(kù)制備方法研究現(xiàn)在國(guó)內(nèi)microRNA測(cè)序文庫(kù)制備還依賴于進(jìn)口試劑盒，給國(guó)內(nèi)的microRNA研究帶來(lái)了不便。成功的microRNA測(cè)序文庫(kù)制備對(duì)于測(cè)序結(jié)果的重要性不言而喻，尤其是在microRNA表達(dá)譜的研究上。好的文庫(kù)制備能維持較高的保真度，能夠反映出真實(shí)的生物學(xué)意義。我們分別使用雙鏈接頭或者單

7、鏈接頭對(duì)microRNA進(jìn)行連接、逆轉(zhuǎn)錄，以及PCR擴(kuò)增，在這個(gè)過(guò)程中優(yōu)化了反應(yīng)條件，最終使用一端封閉的單鏈接頭方案，制備出接近于進(jìn)口試劑盒質(zhì)量的microRNA測(cè)序文庫(kù)。三、子癇病人胎盤和外周血microIRNA測(cè)序子癇(preeclampsia)是一種以孕期高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鞯募膊?，其發(fā)病機(jī)理還未清楚。本文通過(guò)對(duì)子癇病人胎盤的microRNA進(jìn)行測(cè)序并結(jié)合熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)有106種microRNA在PE病人胎盤中下調(diào)，51種在