膽道閉鎖患兒循環(huán)microRNA的高通量測序分析.pdf

1、研究背景:膽道閉鎖（BA）是發(fā)生在嬰幼兒期的嚴(yán)重肝臟疾病之一，可導(dǎo)致肝內(nèi)外膽道不同程度的纖維化閉鎖?；純荷蟛痪镁蜁霈F(xiàn)阻塞性黃疸的癥狀，如不及時診治可引起嚴(yán)重的膽汁淤積和迅速發(fā)展的肝硬化，隨即出現(xiàn)肝脾腫大、腹水、靜脈曲張、凝血功能障礙等門脈高壓征象和肝功能失代償，最終需接受肝移植。疏通膽道、恢復(fù)膽汁流的肝門空腸吻合術(shù)(Kasai術(shù)，葛西術(shù))則是延長患兒自體肝生存、等待肝移植的姑息治療手段。但Kasai術(shù)強調(diào)早期診斷和早期治療，若術(shù)齡超

2、過90天，膽汁引流失敗率會明顯升高，與肝移植之間的間隔時間明顯縮短。近幾年我國大陸地區(qū)雖然每年已有相當(dāng)多膽道閉鎖患兒接受了Kasai術(shù)，但是與國際上相比，我們的自體肝生存率前景堪憂。盡可能早的對BA患兒做出正確的診斷一直以來是小兒外科領(lǐng)域研究的熱點和難點。
　　然而，直至目前為止臨床上并未發(fā)現(xiàn)能確診BA的單獨檢查方法，現(xiàn)有的一些BA特異的實驗室指標(biāo)（r-GT、TB、DB等）和影像學(xué)檢查（B超、CT、ERCP、MRCP等）都無法將B

3、A與其它嬰幼兒膽汁淤積性疾病相鑒別，如何進行早期無創(chuàng)診斷仍是未解的難題。
　　近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA可作為多種疾病的診斷標(biāo)志物，同時研究顯示在BA患兒以及BA動物模型中皆存在miRNA表達與調(diào)控異常，提示miRNA可能參與BA的發(fā)病。研究人員用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-200/429家族在BA患兒血清中高表達，提示miR-200/429家族可作為BA的診斷標(biāo)志物。本研究擬采用Illumina下一代高通量測序技術(shù)（

4、NGS）篩選出BA特異性的miRNA表達譜，找出BA循環(huán)miRNA候選診斷標(biāo)志物，為BA的無創(chuàng)性診斷提供科學(xué)依據(jù)，同時為BA的發(fā)病機制研究提供新的思路和線索。
　　目的:用Illumina高通量測序技術(shù)對BA患兒和正常對照組血漿miRNA進行測序，構(gòu)建BA與對照組間miRNA文庫。比較BA和對照組間miRNA的表達差異，從而構(gòu)建BA特異性血漿循環(huán)miRNA表達譜。并進一步找出具有BA診斷性生物標(biāo)志的miRNA，為尋找新的無創(chuàng)診斷標(biāo)

5、志物和發(fā)病機制研究提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.用Illumina二代高通量測序平臺Hiseq2000對BA患兒的血漿樣本混合池和正常對照組血漿樣本混合池的miRNA進行深度測序分析；
　　2.應(yīng)用生物信息學(xué)分析BA患兒與健康嬰幼兒對照組中血漿miRNA的表達差異，構(gòu)建BA患兒特征性的miRNA表達譜；
　　3. RT-PCR擴大樣本量驗證BA特異性miRNA在BA組，膽汁淤積性疾病對照組和正常對照組間的差異表

6、達，用2-ΔΔCt表示miRNA的相對表達量；
　　4.采用ROC曲線評估BA特異性miRNA在BA診斷中的應(yīng)用價值；
　　5.用相關(guān)靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miRNA的靶基因和相關(guān)信號通路。
　　結(jié)果：
　　1. BA血漿miRNA差異表達分析
　　應(yīng)用高通量測序分析，在BA組和正常對照組中，發(fā)現(xiàn)表達差異在2倍以上的miRNA有146個，其中15個miRNA歸一化后的表達量大于1000，7個上調(diào)，8個下調(diào)，這1

7、5個miRNA構(gòu)成BA循環(huán)miRNA表達譜。有6個miRNA歸一化后的表達量大于5000，分別是表達上調(diào)的miR-122-5p，miR-100-5p和表達下調(diào)的miR-140-3p、miR-10b-5p、miR-26a-5p、miR-126-3p。
　　2．RT-PCR擴大樣本量驗證BA特異性miRNA的差異表達
　　針對測序結(jié)果篩選出的BA特異性miRNA，采用RT-PCR對44例BA患兒，20例膽汁淤積性疾病對照組患兒和

8、20例正常對照組的血漿miRNA進行驗證。與正常對照相比，miR-122-5p和miR-100-5p在BA患兒組血漿中的表達上調(diào)；miR-140-3p和miR-126-3p在BA患兒血漿中表達下調(diào)，與測序結(jié)果一致，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。與正常對照組相比，miR-122-5p和miR-100-5p在膽汁淤積性疾病對照組中的表達量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。BA組與正常對照組和膽汁淤積性疾病對照組相比，miR-140-3p

9、在BA中表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。miR-10b-5p和miR-26a-5p在三組之間表達均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3. ROC曲線評估BA特異性miRNA在BA診斷中的應(yīng)用價值
　　根據(jù)測序結(jié)果和RT-PCR驗證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在BA中特異性表達。miR-140-3p在評估44例BA與40例非BA人群（包括膽汁淤積性疾病和健康人群）的曲線下面積（AUC）為0.75，95％置信區(qū)間為0.644-0.856，p值

10、<0.001。當(dāng)最佳截斷值（cut-off值）為0.083時，特異度為79.1%，靈敏度為66.7%。
　　4. BA特異性miRNA的靶基因預(yù)測
　　采用靶基因預(yù)測軟件預(yù)測到miR-140-3p的靶基因FGF9、MMP家族、IGF-1R、PDGF、CTGF、TGF-βR1、Notch2、Wnt5A等與BA相關(guān)，這些靶基因參與膽管的發(fā)育和分化、肝纖維化的發(fā)生、細胞外基質(zhì)的形成等。
　　結(jié)論:
　　1.本研究利用二

11、代高通量測序技術(shù)成功構(gòu)建了BA差異性miRNA表達譜，這些差異表達的miRNA與膽管的發(fā)育分化、細胞外基質(zhì)的形成、肝纖維化的發(fā)生相關(guān)。其中部分miRNA為之前已研究發(fā)現(xiàn)的miRNA，部分為本研究新發(fā)現(xiàn)的miRNA。
　　2.通過采用stem-loop RT-PCR方法擴大樣本量對表達豐度高、個體間表達穩(wěn)定的6個差異miRNA進行單個樣本驗證分析，其中miR-122-5p、miR-100-5p、miR-140-3p、miR-126-