版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、一、背景:
高通量測序(也稱下一代測序技術)技術具有強大的平行測序能力,被廣泛應用于生命科學研究領域。近年來隨著成本的降低和應用成熟度的增加,其在臨床基因檢測中備受青睞。高通量測序在用藥指導方面應用廣泛,如腫瘤個體化治療基因檢測,相對于傳統(tǒng)檢測,更能全面覆蓋基因變異情況,為患者個體化用藥提供更多參考。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus:HBV)耐藥問題嚴重,目前臨床用于治療慢性乙肝的藥物是核苷類藥物,
2、長期治療都會引起不同程度的耐藥現(xiàn)象,密切監(jiān)測耐藥的產生,及時調整治療方案,已經成為醫(yī)患關注的重點問題。已知與耐藥相關的絕大部分突變均位于HBV聚合酶基因的逆轉錄酶區(qū)?,F(xiàn)有的檢測HBV突變方法有聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction:PCR)直接測序法,由于靈敏度的限制,該方法只在群體中特定突變占20%以上時才能檢測到;PCR產物克隆測序法,可大致確定不同序列毒株之間的相對比例有助于發(fā)現(xiàn)混合株,但操作繁瑣且靈敏度
3、有限。此外,實時定量PCR,限制性片段長度多態(tài)性技術,線性探針反向雜交法在臨床使用中,雖然靈敏度各不相同,但都只能針對特定已知耐藥位點,針對每一個位點分別設計探針/引物,效率低下。
目前,下一代測序技術(Next generation sequencing:NGS)在HBV耐藥檢測中的應用較少,尤其是具有實用價值的NGS檢測HBV耐藥突變方法未見報道。本文擬建立可用于臨床用藥指導的HBV耐藥基因位點高通量測序檢測方法,該方法能
4、夠對包括HBV聚合酶基因內的全部耐藥相關區(qū)段進行分析,發(fā)現(xiàn)患者HBV耐藥位點,為HBV感染患者的個體化治療提供依據(jù)。
二、方法:
本文的第一部分是基于高通量測序的乙肝耐藥位點檢測方法的建立,首先針對耐藥位點所在區(qū)域設計特異引物,并對其進行優(yōu)化;然后采用融合引物(Fusion method primer)策略設計適用于Thermo Life Ion Torrent PGM平臺及Illumina Miseq高通量測序平臺
5、的引物,即在設計好的目標特異引物的基礎上,添加適用于高通量測序的接頭和標簽序列,以此引物擴增乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(Hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid,HBV DNA)獲得上機文庫。然后進行測序操作獲得目標區(qū)域的基因序列信息,并對其進行分析。本文第二部分對基于高通量測序技術的乙肝耐藥突變位點檢測方法進行驗證和臨床樣本檢測。還利用以上建庫引物,對濃度梯度的HBV DNA標準物質進行了文庫構建,
6、以評價本方法的靈敏度;利用耐藥位點區(qū)域存在差異的兩種乙肝病毒基因組質?;旌夏M樣對高通量測序方法的突變率檢測能力進行評價,選B型和C型HBV基因組質粒按1:99,5:95,10:90三種比例混合建庫,并在Ion Torrent PGM和 Miseq上進行上機測序,統(tǒng)計B型、C型兩種HBV DNA差異堿基的檢測效率;采用突變引物構建HBV突變質粒標準品,突變型和野生型HBV基因組質粒按1:99,5:95,10:90三種比例混合建庫,并在I
7、on TorrentPGM上進行測序,統(tǒng)計突變堿基的檢測效率,對本研究設計的高通量測序方法的突變檢出能力進行評價。進一步,收集了15例慢性乙肝患者血液樣本,用PureLink? Viral RNA/DNA Mini試劑盒提取HBV DNA。患者血清HBV DNA用建立的 Ion Torrent PGM方法檢測,樣本同時進行Sanger法測序。
三、結果:
1.對使用特異引物擴增的PCR產物進行毛細管電泳檢測分析產物長
8、度和測序驗證序列,結果表明特異引物擴增特異。PCR產物分為三個片段,大小分別是165bp、324bp和135bp,覆蓋的耐藥位點包括L80V/I,I169T,V173L,L180M,A181T/V,T184A,S202G/I,M204I/V/S,V214A,Q215S,N236T,M250V,G1896A。
2.設計了Ion Torrent PGM的擴增子引物和基于Miseq平臺的引物,并對引物擴增產物進行了毛細管電泳檢測,結
9、果表明產物長度分別為244bp、467bp、320bp和296bp、559bp、218bp,一代測序證明其序列正確,表明測序引物擴增正確;對構建的質粒標準品各步產物都采用毛細管電泳檢測,構建的質粒采用毛細管電泳檢測和Sanger法一代測序鑒定,結果顯示 HBV突變質粒構建成功。
3.基于Ion Torrent? PGM平臺的融合引物建庫方法檢測靈敏度可達50IU/mL,建立了適用于Ion Torrent? PGM平臺和Mise
10、q平臺的擴增子文庫構建方法,該方法可對HBV>50 IU/mL的血清進行建庫。對模擬樣中突變率在5%及其以上的位點可很好的檢出(信噪比>10);對模擬樣中突變率在1%豐度的位點可檢出9/10,(信噪比>10)。15例臨床樣品的檢出8個耐藥位點,這些位點不能被臨床常用的Sanger法檢測到。
四、結論:
初步建立了高通量測序檢測 HBV耐藥突變的檢測方法,為臨床動態(tài)監(jiān)測乙肝病毒耐藥位點突變、指導合理臨床用藥奠定了基礎。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 基于目標捕獲和高通量測序檢測耐藥細菌的研究.pdf
- 高通量測序技術簡介
- 高通量測序
- 27572.基于solid高通量測序技術的樣品準備方法研究
- 高通量測序在乙肝相關肝癌患者HBV變異檢測中的應用.pdf
- 基因突變的檢測方法
- 基于腫瘤基因高通量捕獲測序技術的肝癌分子分型研究.pdf
- 基于高通量測序技術的非編碼RNA研究.pdf
- 基于高通量測序技術的全基因組甲基化研究.pdf
- 乙型肝炎治療耐藥基因突變的焦磷酸測序診斷技術研究.pdf
- 基于高通量測序的石刁柏基因轉座子分析.pdf
- 基于高通量測序技術的朱砂葉螨抗性相關基因分析.pdf
- 中藥體外致突變性高通量檢測方法的探索.pdf
- 基于高通量測序的Klebsiella pneumoniae基因組拼接的研究.pdf
- 基因突變敏感性分子開關檢測HIV-1耐藥基因突變.pdf
- 高通量基因測序堿基識別中圖像去噪的方法研究.pdf
- 肺癌EGFR的基因突變檢測方法研究.pdf
- 高通量測序分析乙肝疫苗接種失敗兒童及母親HBV全基因變異.pdf
- 基于高通量測序半夏珠芽轉錄組研究.pdf
- 基于高通量測序的微生物基因組學研究.pdf
評論
0/150
提交評論