血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2在CCL-,4-誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的：各種病因引起的慢性肝病或損害絕大多數(shù)都存在肝纖維化，其中25％～40％最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，因此肝纖維化是一類嚴重危害人類健康的世界性疾病。大量研究表明肝纖維化是一個動態(tài)的可逆性的病變過程，因此深入研究其發(fā)病機理，尋找有效的治療靶點，積極有效的阻斷或逆轉(zhuǎn)纖維化發(fā)生發(fā)展對防治肝硬化和肝癌具有重大的理論和實際意義。越來越多的研究表明腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)在慢性肝臟損傷、纖維化中起著重要的作用。許多組織如肝臟、

2、心臟和腎臟等都存在局部RAS，可以合成血管緊張素II(AngII)及RAS的其他成分，以旁分泌、自分泌的方式發(fā)揮作用。肝損傷或肝硬化時RAS上調(diào)。大量實驗表明抑制RAS系統(tǒng)可以明顯改善肝纖維化。2000年發(fā)現(xiàn)的人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的一種同源類似物-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)使RAS系統(tǒng)變得更加復(fù)雜。ACE2能水解血管緊張素I(AngI)和AngII分別生成血管緊張素1-9(Ang1-9)和血管緊張素1-7(Ang1-7)，具有重要的

3、調(diào)控RAS作用。ACE2廣泛參與心血管疾病、糖尿病腎病等疾病的病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)ACE2還是SARS冠狀病毒的功能性受體，參與介導(dǎo)病毒的入侵和細胞融合。目前有關(guān)ACE2在肝纖維化方面的研究甚少，尤其是對ACE2在纖維化形成中的機制研究尚屬空白。RNA干擾(RNAi)是近些年來發(fā)展起來的生物學(xué)技術(shù)，具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，是研究基因功能的一種有效工具。本課題旨在研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展中AC

4、E2基因表達的變化及其與肝纖維化病理分級及肝功能的關(guān)系；利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建靶向ACE2基因的RNAi慢病毒顆粒，研究慢病毒介導(dǎo)的ACE2基因沉默在大鼠肝纖維化形成中的作用及機制。 方法：①以四氯化碳皮下注射建立大鼠肝纖維模型。分別在注射前(0周)及注射后第2、4、6周取肝組織，進行H-E及Sirius red染色并做病理學(xué)評估。運用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測不同時間點肝纖維大鼠肝臟ACE2和A

5、CE基因的表達變化。進一步分析ACE2基因與纖維化病理分級、肝功能、ACE基因的相關(guān)性。②參照RNAi設(shè)計原則，應(yīng)用RNAi設(shè)計軟件針對ACE2靶基因序列設(shè)計4個RNAi靶點序列，合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo,直接連入酶切后的RNA干擾載體(pGCSIL-GFP)上，陽性克隆經(jīng)PCR分析和測序鑒定；將構(gòu)建成功靶向ACE2的重組RNAi慢病毒載體與2種輔助包裝載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)48h后，收集細胞上清液，濃縮后得到高滴

6、度的慢病毒濃縮液，在29T細胞中測定并標定病毒滴度；靶向ACE2的重組RNAi慢病毒顆粒(lenti-siACE2)感染HSC-T6細胞，采用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測ACE2的表達，篩選干擾效果最好的靶點，并對含該靶點的重組RNAi慢病毒顆粒進行大量包裝，以滿足下一步實驗的需要。③建立腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入慢病毒的方法，運用共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白marker(GFP)的表達，研究慢病毒在體內(nèi)持續(xù)表達的

7、時間及在體內(nèi)組織器官的分布；運用Realtime-PCR和Western Blot方法分析腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入靶向ACE2的重組RNAi慢病毒顆粒對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織ACE2基因表達的抑制效率。④應(yīng)用H-E及Sirius red膠原染色、免疫組化、Realtime-PCR的方法分析沉默ACE2基因?qū)w維化大鼠肝組織學(xué)的變化以及對ACE、α-SMA、TIMP-1、COL-I、COL-III等基因的表達的影響。⑤應(yīng)用ELIS

8、A法檢測沉默ACE2基因?qū)Ω谓M織中AngII含量的影響。應(yīng)用全自動化生化分析儀分析沉默ACE2基因?qū)Υ笫笱錋LT/AST的影響。 結(jié)果：①正常肝組織ACE2 mRNA低表達，在造模后ACE2 mRNA表達逐漸升高。與對照組相比，ACE2 mRNA的表達在造模2、4、6周后，分別升高3.08倍、3.57倍、6.5倍。其蛋白表達亦得到類似結(jié)果。在肝纖維化不同時期ACE2與ACE mRNA的表達具有良好相關(guān)性；ACE2mRNA表達與

9、肝纖維化評分具有顯著相關(guān)性，隨著肝纖維化程度的加重，ACE2 mRNA表達亦相應(yīng)明顯增加；同時大鼠肝組織ACE2 mRNA的表達與ALT和AST水平具有良好的相關(guān)性，與Tbil、ALB等無明顯相關(guān)；②針對ACE2靶基因序列設(shè)計4個RNAi靶點序列，構(gòu)建RNAi慢病毒載體，PCR分析和測序鑒定RNAi靶點序列成功插入預(yù)計位點，并且序列正確。Realtime-PCR和Western Blot分析表明PscSI663靶點的RNAi慢病毒對HS

10、C-T6細胞ACE2的表達敲減效率最高。對含該靶點的重組RNAi慢病毒顆粒進行大量包裝，測定病毒滴度為3×108 TU/ml。③運用我們建立的腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入慢病毒顆粒的方法將慢病毒導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，共聚焦顯微鏡觀察顯示，感染慢病毒2周后肝組織可見GFP表達，至少可以維持9周。GFP主要在肝臟表達，心、肺、脾、腎等臟器基本觀察不到GFP的表達。Realtime-PCR分析表明腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入lenti-siACE2預(yù)處理后，再注

11、射CCl40，2，4，6周后RNAi組ACE2基因mRNA較對照組分別下降了73.3％，90.1％，72.7％，75.3％，而對ACE基因的表達無明顯影響。④沉默ACE2基因可明顯加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化；明顯上調(diào)肝組織α-SMA、TIMP-1、COL-I、COL-III等基因的表達；明顯升高肝組織AngII的含量，升高血清ALT/AST的水平。 結(jié)論：①腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入慢病毒顆粒的方法可以實現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的表達GFP，具有