血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2在CCL-,4-誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：各種病因引起的慢性肝病或損害絕大多數(shù)都存在肝纖維化，其中25％～40％最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，因此肝纖維化是一類嚴(yán)重危害人類健康的世界性疾病。大量研究表明肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆性的病變過(guò)程，因此深入研究其發(fā)病機(jī)理，尋找有效的治療靶點(diǎn)，積極有效的阻斷或逆轉(zhuǎn)纖維化發(fā)生發(fā)展對(duì)防治肝硬化和肝癌具有重大的理論和實(shí)際意義。越來(lái)越多的研究表明腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)在慢性肝臟損傷、纖維化中起著重要的作用。許多組織如肝臟、

2、心臟和腎臟等都存在局部RAS，可以合成血管緊張素II(AngII)及RAS的其他成分，以旁分泌、自分泌的方式發(fā)揮作用。肝損傷或肝硬化時(shí)RAS上調(diào)。大量實(shí)驗(yàn)表明抑制RAS系統(tǒng)可以明顯改善肝纖維化。2000年發(fā)現(xiàn)的人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的一種同源類似物-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)使RAS系統(tǒng)變得更加復(fù)雜。ACE2能水解血管緊張素I(AngI)和AngII分別生成血管緊張素1-9(Ang1-9)和血管緊張素1-7(Ang1-7)，具有重要的

3、調(diào)控RAS作用。ACE2廣泛參與心血管疾病、糖尿病腎病等疾病的病理生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)ACE2還是SARS冠狀病毒的功能性受體，參與介導(dǎo)病毒的入侵和細(xì)胞融合。目前有關(guān)ACE2在肝纖維化方面的研究甚少，尤其是對(duì)ACE2在纖維化形成中的機(jī)制研究尚屬空白。RNA干擾(RNAi)是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的生物學(xué)技術(shù)，具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，是研究基因功能的一種有效工具。本課題旨在研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展中AC

4、E2基因表達(dá)的變化及其與肝纖維化病理分級(jí)及肝功能的關(guān)系；利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建靶向ACE2基因的RNAi慢病毒顆粒，研究慢病毒介導(dǎo)的ACE2基因沉默在大鼠肝纖維化形成中的作用及機(jī)制。 方法：①以四氯化碳皮下注射建立大鼠肝纖維模型。分別在注射前(0周)及注射后第2、4、6周取肝組織，進(jìn)行H-E及Sirius red染色并做病理學(xué)評(píng)估。運(yùn)用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)肝纖維大鼠肝臟ACE2和A

5、CE基因的表達(dá)變化。進(jìn)一步分析ACE2基因與纖維化病理分級(jí)、肝功能、ACE基因的相關(guān)性。②參照RNAi設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用RNAi設(shè)計(jì)軟件針對(duì)ACE2靶基因序列設(shè)計(jì)4個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo,直接連入酶切后的RNA干擾載體(pGCSIL-GFP)上，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR分析和測(cè)序鑒定；將構(gòu)建成功靶向ACE2的重組RNAi慢病毒載體與2種輔助包裝載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞上清液，濃縮后得到高滴

6、度的慢病毒濃縮液，在29T細(xì)胞中測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度；靶向ACE2的重組RNAi慢病毒顆粒(lenti-siACE2)感染HSC-T6細(xì)胞，采用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測(cè)ACE2的表達(dá)，篩選干擾效果最好的靶點(diǎn)，并對(duì)含該靶點(diǎn)的重組RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行大量包裝，以滿足下一步實(shí)驗(yàn)的需要。③建立腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入慢病毒的方法，運(yùn)用共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白marker(GFP)的表達(dá)，研究慢病毒在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)的

7、時(shí)間及在體內(nèi)組織器官的分布；運(yùn)用Realtime-PCR和Western Blot方法分析腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入靶向ACE2的重組RNAi慢病毒顆粒對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織ACE2基因表達(dá)的抑制效率。④應(yīng)用H-E及Sirius red膠原染色、免疫組化、Realtime-PCR的方法分析沉默ACE2基因?qū)w維化大鼠肝組織學(xué)的變化以及對(duì)ACE、α-SMA、TIMP-1、COL-I、COL-III等基因的表達(dá)的影響。⑤應(yīng)用ELIS

8、A法檢測(cè)沉默ACE2基因?qū)Ω谓M織中AngII含量的影響。應(yīng)用全自動(dòng)化生化分析儀分析沉默ACE2基因?qū)Υ笫笱錋LT/AST的影響。 結(jié)果：①正常肝組織ACE2 mRNA低表達(dá)，在造模后ACE2 mRNA表達(dá)逐漸升高。與對(duì)照組相比，ACE2 mRNA的表達(dá)在造模2、4、6周后，分別升高3.08倍、3.57倍、6.5倍。其蛋白表達(dá)亦得到類似結(jié)果。在肝纖維化不同時(shí)期ACE2與ACE mRNA的表達(dá)具有良好相關(guān)性；ACE2mRNA表達(dá)與

9、肝纖維化評(píng)分具有顯著相關(guān)性，隨著肝纖維化程度的加重，ACE2 mRNA表達(dá)亦相應(yīng)明顯增加；同時(shí)大鼠肝組織ACE2 mRNA的表達(dá)與ALT和AST水平具有良好的相關(guān)性，與Tbil、ALB等無(wú)明顯相關(guān)；②針對(duì)ACE2靶基因序列設(shè)計(jì)4個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，構(gòu)建RNAi慢病毒載體，PCR分析和測(cè)序鑒定RNAi靶點(diǎn)序列成功插入預(yù)計(jì)位點(diǎn)，并且序列正確。Realtime-PCR和Western Blot分析表明PscSI663靶點(diǎn)的RNAi慢病毒對(duì)HS

10、C-T6細(xì)胞ACE2的表達(dá)敲減效率最高。對(duì)含該靶點(diǎn)的重組RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行大量包裝，測(cè)定病毒滴度為3×108 TU/ml。③運(yùn)用我們建立的腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入慢病毒顆粒的方法將慢病毒導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，共聚焦顯微鏡觀察顯示，感染慢病毒2周后肝組織可見(jiàn)GFP表達(dá)，至少可以維持9周。GFP主要在肝臟表達(dá)，心、肺、脾、腎等臟器基本觀察不到GFP的表達(dá)。Realtime-PCR分析表明腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入lenti-siACE2預(yù)處理后，再注

11、射CCl40，2，4，6周后RNAi組ACE2基因mRNA較對(duì)照組分別下降了73.3％，90.1％，72.7％，75.3％，而對(duì)ACE基因的表達(dá)無(wú)明顯影響。④沉默ACE2基因可明顯加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化；明顯上調(diào)肝組織α-SMA、TIMP-1、COL-I、COL-III等基因的表達(dá)；明顯升高肝組織AngII的含量，升高血清ALT/AST的水平。 結(jié)論：①腸系膜分支靜脈注射導(dǎo)入慢病毒顆粒的方法可以實(shí)現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)GFP，具有