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文檔簡介
1、前言
一氧化氮合酶包括:神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)。其中,iNOS在正常生理狀態(tài)下不表達(dá)或表達(dá)量極低,只有誘導(dǎo)后才大量表達(dá),因此iNOS基因表達(dá)調(diào)控對NO的產(chǎn)生至關(guān)重要。iNOS基因在原發(fā)性高血壓發(fā)生中發(fā)揮重要作用,一方面iNOS可通過產(chǎn)生NO引起血管平滑肌細(xì)胞舒張降低血壓,另一方面還通過NO衍生物一過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)發(fā)揮促高血壓作用。
2、> 本課題組前期研究中,通過高血壓高發(fā)區(qū)連鎖分析發(fā)現(xiàn)17號染色體上的微衛(wèi)星D17S1878與高血壓存在連鎖。進(jìn)一步病例.對照人群和家系研究證實(shí),iNOS基因啟動(dòng)子-1026C/A多態(tài)與高血壓發(fā)生相關(guān),其中-1026C等位基因及-1026CC基因型是高血壓發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外對iNOS啟動(dòng)子-1026C/A多態(tài)的初步功能研究發(fā)現(xiàn),-1026位點(diǎn)存在轉(zhuǎn)錄因子YY1反應(yīng)元件,-1026C/A多態(tài)影響了YY1-DNA結(jié)合模式以及iNO
3、S啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因重組體p1173C/A-luc的轉(zhuǎn)錄活性,并推測可能繼而通過影響NO的產(chǎn)生導(dǎo)致-1026C/C的高血壓易感風(fēng)險(xiǎn)升高。然而,YY1是如何影響iNOS啟動(dòng)子,-1026C/A多態(tài)對iNOS基因轉(zhuǎn)錄的確切功能,以及多種高血壓相關(guān)因子調(diào)控iNOS轉(zhuǎn)錄活性的效應(yīng)和具體機(jī)制尚不明確。
材料與方法
一、實(shí)驗(yàn)材料
1、細(xì)胞系:人喉鱗癌細(xì)胞(Hep2),人胃癌細(xì)胞(BGC823),非洲綠猴
4、腎(COS-7),小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7):
2、載體:螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體、海腎熒光素酶表達(dá)載體、YY1表達(dá)及RNA干擾載體、NFIC野生型及突變型表達(dá)載體、c-Jun 表達(dá)載體、雌激素受體表達(dá)載體、糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)載體、鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)載體、p300野生型及突變型表達(dá)載體;
3、Western印跡雜交相關(guān)試劑及試劑盒;
4、基因克隆及螢光素酶報(bào)告基因檢測相關(guān)試劑及試劑盒;
5、> 5、DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、電泳泳動(dòng)遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)及染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)相關(guān)試劑及試劑盒;
6、Real-time PCR相關(guān)試劑及試劑盒;
7、細(xì)胞刺激因子:細(xì)胞因子混合物(IFN-γ、IL-1β和TNF-α)、丁酸鈉、雌二醇、地塞米松、醛固酮、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、胰島素樣生長因子Ⅱ和胰島素。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1、iNOS啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因載體
6、構(gòu)建及檢測:利用在線軟件進(jìn)行iNOS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析,構(gòu)建系列截短的螢光素酶報(bào)告基因重組體,應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測啟動(dòng)子的活性,鑒定iNOS基因關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū);
2、應(yīng)用DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、EMSA和ChIP方法鑒定iNOS啟動(dòng)子-1026C/A多態(tài)位點(diǎn)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物組成,各轉(zhuǎn)錄因子相互作用,及DNA-結(jié)合親和力;
3、共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子及激素受體表達(dá)載體,應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)
7、,檢測YY1、NFI和AP-1對iNOS基礎(chǔ)啟動(dòng)子活性的影響;以及雌二醇、地塞米松、醛固酮、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、胰島素樣生長因子Ⅱ和胰島素在iNOS轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用;
4、Real-time PCR方法檢測YY1、NFI和AP-1過表達(dá)對細(xì)胞因子混合物誘導(dǎo)后iNOS mRNA表達(dá)的影響;
5、丁酸鈉刺激,以及共轉(zhuǎn)染野生型/突變型p300表達(dá)載體,檢測乙?;趇NOS表達(dá)調(diào)控中的作用。
結(jié)果
8、> 1、系列截短的螢光素酶報(bào)告基因活性檢測發(fā)現(xiàn)iNOS啟動(dòng)子-1173bp~-1032bp的141-bp片段可能為負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū);含有-1026C/A多態(tài)位點(diǎn)的16-bp片段(-1032 bp~-1016 bp)為iNOS基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵正性調(diào)控區(qū)。
2、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),除YY1外,iNOS啟動(dòng)子-1026C/A位點(diǎn)還存在另兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子NFI和AP-1,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示,-1026C/A位點(diǎn)存在由YY1
9、,NFI和AP-1組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物,其中YY1與-1026C優(yōu)勢結(jié)合,而NFI與-1026A優(yōu)勢結(jié)合,免疫共沉淀結(jié)果提示AP-1和NFI之間存在相互作用,NFI和YY1之間也可能存在相互作用,而AP-1和YY1之間可能無直接的相互作用。
3、EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)NFI能與-1026A特異性直接結(jié)合,而AP-1與-1026A之間的結(jié)合可能是間接的,ChIP實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞內(nèi)NFI和YY1與含有-1026C/A位點(diǎn)iNOS啟動(dòng)子結(jié)合
10、,且YY1與-1026C結(jié)合親和力較強(qiáng),NFI與-1026A結(jié)合親和力較強(qiáng)。
4、通過YY1和NFI過表達(dá)及YY1的RNA干擾后檢測p1173C/A-luc和p1032C/A-luc轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)現(xiàn)YY1和NFI抑制iNOS基礎(chǔ)啟動(dòng)子活性,該負(fù)性調(diào)控作用受正性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP-1的影響;其中,YY1的抑制作用明顯強(qiáng)于NFI。
5、Real-time PCR結(jié)果顯示,細(xì)胞因子混合物(IFN-γ、IL-1β和TNF
11、-α)顯著誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞iNOS表達(dá),YY1、NFI或AP-1單獨(dú)過表達(dá)對iNOS的誘導(dǎo)表達(dá)影響不明顯,而AP-1/NF1或AP-1/YY1聯(lián)合過表達(dá)均抑制iNOS的誘導(dǎo)表達(dá),且AP-1/YY1的抑制作用明顯強(qiáng)于AP-1/NF1。
6、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析顯示iNOS基因啟動(dòng)子1.2 kb序列中還存在一個(gè)TATAbox、NF-кB/C/EBP、C/EBP、Sp1以及多個(gè)糖皮質(zhì)激素和雌激素反應(yīng)元件;
7、體外
12、培養(yǎng)BGC823、Hep2、COS-7和RAW264.7細(xì)胞發(fā)現(xiàn),p1173C/A-luc轉(zhuǎn)錄活性在不同細(xì)胞系中差異明顯,而-1026C/A在不同細(xì)胞系中均影響iNOS啟動(dòng)子活性。
8、類固醇激素(雌二醇、地塞米松、醛固酮)刺激及其受體過表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,雌激素下調(diào)p1173A-luc轉(zhuǎn)錄活性依賴于雌激素受體,醛固酮及鹽皮質(zhì)激素受體有上調(diào)p1173A-luc轉(zhuǎn)錄活性的趨勢,而地塞米松及糖皮質(zhì)激素受體對p1173A-luc轉(zhuǎn)
13、錄活性無明顯作用;此外,p1173C-luc轉(zhuǎn)錄活性不受這些激素的影響。
9、應(yīng)用去乙?;敢种苿┒∷徕c刺激,以及乙酰轉(zhuǎn)移酶輔助因子p300的過表達(dá)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)丁酸鈉處理可顯著降低p1173C-luc和p1173A-luc的轉(zhuǎn)錄活性,且對p1173A-luc的抑制作用較強(qiáng);而共轉(zhuǎn)染野生型p300后p1173C-luc和p1173A-luc轉(zhuǎn)錄活性無顯著變化;提示由丁酸鈉介導(dǎo)的乙?;揎椏赡芤种苅NOS因的基礎(chǔ)啟動(dòng)子活性。
14、r> 10、應(yīng)用血壓調(diào)節(jié)因子(TGF-β1、IGF Ⅱ和胰島素)處理Hep2細(xì)胞后p1173C/A-luc轉(zhuǎn)錄活性均無明顯改變,-1026C/A多態(tài)的作用仍很顯著,提示人iNOS基因1.2 kb啟動(dòng)子可能不是這些血壓調(diào)節(jié)因子的直接作用靶點(diǎn)。
結(jié)論
1、iNOS啟動(dòng)子-1026C/A多態(tài)位點(diǎn)所在16-bp片段是基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控區(qū),該位點(diǎn)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物包括YY1、NFI和AP-1,其中YY1和N
15、FI直接結(jié)合DNA,而AP-1間接結(jié)合DNA;
2、YY1和NFI與-1026C/A位點(diǎn)的結(jié)合親和力存在差異,YY1與-1026C優(yōu)勢結(jié)合,NFI與-1026A優(yōu)勢結(jié)合;
3、YY1和NFI均抑制iNOS基礎(chǔ)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,且YY1的作用明顯強(qiáng)于NFI,在細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,AP-1/YY1對iNOS基因mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于AP-1/NFI;
4、iNOS基因啟動(dòng)子可能存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)
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