運輸應激條件下弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化差異蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生的原蟲，可以引起嚴重的人畜共患寄生蟲病。弓形蟲宿主范圍極其廣泛，可以感染家禽、家畜、伴侶動物以及人類在內(nèi)的所有溫血動物。對于免疫功能健全的個體，弓形蟲的感染不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，蟲體多以半休眠的組織包囊形式在宿主腦部、肌肉及眼部定居，與機體長期共存。但是包囊并不是無威脅的存在，當宿主的免疫力低下時，包囊會再活化，進而由緩殖子轉(zhuǎn)變?yōu)樗僦匙樱鸺毙愿腥?。因此，弓形蟲速殖

2、子和緩殖子的轉(zhuǎn)化在弓形蟲致病過程中扮演著關(guān)鍵的角色。研究表明，運輸應激可以降低宿主的免疫力，從而導致多種疾病的復發(fā)，據(jù)此推測，弓形蟲作為一種機會性致病病原體，運輸應激可能誘發(fā)弓形蟲慢性感染小鼠腦內(nèi)包囊的再活化。
　　弓形蟲速殖子和緩殖子轉(zhuǎn)化過程中，多種期特異性蛋白、熱休克蛋白以及代謝酶類的表達發(fā)生明顯變化，它們對弓形蟲的生長以及代謝有著重要的調(diào)控作用。因此，本研究針對弓形蟲速殖子和緩殖子轉(zhuǎn)化過程中可能的差異蛋白進行篩選及鑒定。

3、r>　　本研究首先建立運輸應激誘導弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化的動物模型，驗證了運輸應激誘使包囊再活化，即由緩殖子轉(zhuǎn)化成速殖子;隨后模擬運輸應激，利用細胞因子抗體芯片檢測小鼠血清中細胞因子的變化，結(jié)果顯示小鼠外周血血清中γ干擾素（IFN-γ），白細胞介素(IL-1α)，白細胞介素(IL-4)，白細胞介素（IL-10），白細胞介素(IL-12)以及巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的表達水平在應激后顯著下降;最后利用雙向電泳以及質(zhì)譜鑒定技術(shù)篩

4、選并鑒定出了緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化過程中的47個鼠源蛋白和15個弓形蟲蛋白。具體工作包括以下幾個方面:
　　(1)弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化動物模型的建立
　　利用運輸應激成功誘導弓形蟲腦包囊的再活化，即由緩殖子轉(zhuǎn)變成速殖子。將弓形蟲PRU株慢性感染小鼠模擬運輸應激3天后，利用Real-time PCR分別檢測弓形蟲速殖子期特異性基因SAG1和緩殖子期特異性基因BAG1的mRNA相對表達水平。結(jié)果顯示在運輸應激3天后，BAG1的相

5、對表達水平下降，SAG1的相對表達水平顯著上升，表明運輸應激誘導包囊的再活化，即從緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化。
　　(2)運輸應激影響弓形蟲慢性感染小鼠的免疫水平
　　利用弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化的動物模型，分別收集運輸應激前，應激1天，應激2天，應激3天的小鼠外周血血清，利用細胞因子抗體芯片檢測小鼠細胞因子的變化。結(jié)果顯示，IFN-γ，IL-1α，IL-4，IL-10，IL-12以及M-CSF6種細胞因子水平隨著應激時間的延長逐漸

6、下降，在應激3天后顯著下降。表明運輸應激降低慢性感染小鼠的免疫水平。
　　(3)弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化差異蛋白的篩選及鑒定
　　利用弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化的動物模型，分別收集并純化運輸應激前，應激1天，應激2天，應激3天的小鼠腦組織包囊，提取包囊總蛋白，利用雙向電泳技術(shù)篩選緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化過程中的差異蛋白并進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示，47個鼠源蛋白和15個弓形蟲相關(guān)蛋白的表達量在緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化過程中顯著變化;隨后利用R

7、eal-time PCR驗證了弓形蟲肌動蛋白(Actin)，微線體蛋白13(MIC13)，致密顆粒蛋白9（GRA9），致密顆粒蛋白1(GRA1)和烯醇酶1(ENO1)的mRNA水平在運輸應激后顯著上升，與雙向電泳結(jié)果一致，表明緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化過程中多種宿主和蟲體的蛋白表達發(fā)生變化。
　　本研究利用小鼠運輸應激模型證實了應激導致機體免疫力下降;成功篩選并鑒定出了弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化過程中的47個鼠源蛋白和15個弓形蟲相關(guān)蛋白，