環(huán)巴胺衍生物對乳腺癌生長、轉(zhuǎn)移和放射敏感性影響及機制的研究.pdf

1、惡性腫瘤是危害人類健康最為嚴重的疾病之一。在過去30年中，中國居民的惡性腫瘤死亡率增長了80%以上。惡性腫瘤目前已經(jīng)成為城市居民的首位死因及農(nóng)村居民第二位死亡原因。惡性腫瘤中，乳腺癌是目前威脅女性健康的最主要腫瘤。2010年美國癌癥學(xué)會研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，世界女性惡性腫瘤發(fā)病率占第一位的是乳腺癌，其死亡率居排女性惡性腫瘤的第二位。
　　手術(shù)、放療和化療為目前乳腺癌治療的三大主要手段，雖然乳腺癌的治療較前已得到一定的進步，但對降低乳腺

2、癌患者的死亡率改善不大，多數(shù)乳腺癌病人發(fā)現(xiàn)時已屬腫瘤中晚期，失去了手術(shù)根治的機會，化療和放療對改善病人的生活質(zhì)量，延長這些病人的生存時間意義重大。因此，開發(fā)、研究新的化療及放療增敏藥物是放射生物學(xué)研究的新方向。
　　環(huán)巴胺(cyclopamine)是一種從藜蘆類植物中提取的甾體類化合物，已報道其具有非常好的抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抗腫瘤作用，而且其抗腫瘤作用具有廣譜性，可以抑制多種腫瘤細胞的生長。而且聯(lián)合應(yīng)用可以增加腫瘤細胞的化療和放

3、療的療效。但是環(huán)巴胺不溶于水，也很難溶解在有機或者無機溶劑中，這大大地限制了環(huán)巴胺將來在臨床的廣泛應(yīng)用。本實驗室通過改變環(huán)巴胺的局部化學(xué)結(jié)構(gòu)，改改善了它的溶解性，并得到一系列環(huán)巴胺衍生物，命名為SCJ。本課題是研究環(huán)巴胺衍生物 SCJ在乳腺癌細胞中的生物學(xué)功能以及相關(guān)機制，旨為進一步開展環(huán)巴胺衍生物抗腫瘤作用的基礎(chǔ)和臨床研究提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。本課題實驗內(nèi)容主要分為三大部分：
　　第一部分 SCJ對乳腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移影響的研究<

4、br>　　目的：
　　研究環(huán)巴胺衍生物SCJ-26和SCJ-43在體外對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7生長和轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討其機制。
　　方法：
　　應(yīng)用倒置顯微鏡觀察不同濃度 SCJ-26和 SCJ-43作用后 MDA-MB-231、MCF-7細胞細胞形態(tài)的變化。應(yīng)用MTT法檢測不同濃度SCJ藥物對兩種細胞的生存曲線的影響。通過貼壁實驗來觀察不同濃度 SCJ藥物對乳腺癌細胞貼壁能力的影響。應(yīng)用劃痕實

5、驗檢測SCJ藥物對乳腺癌細胞體外遷移能力的影響。應(yīng)用Boyden小室實驗研究 SCJ藥物對乳腺癌細胞體外轉(zhuǎn)移能力的影響。應(yīng)用流式細胞術(shù)分析SCJ藥物引起兩種細胞細胞周期的變化。應(yīng)用Western blot實驗檢測不同濃度SCJ藥物作用于MDA-MB-231、MCF-7細胞后，細胞周期、凋亡及表皮生長因子受體相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果：
　　細胞培養(yǎng)直接鏡檢及染色結(jié)果顯示，與 MDA-MB-231和 MCF-7細胞比較， SC

6、J-26和SCJ-43處理組的細胞持續(xù)貼壁生長減少，細胞間間隙增多，細胞輪廓逐漸模糊，細胞胞漿腫脹。隨著SCJ-26和SCJ-43濃度的升高，上述細胞形態(tài)表現(xiàn)更明顯，存在一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系?？梢姡琒CJ藥物抑制了兩種細胞的存活率，延長了細胞的貼壁時間，降低了貼壁率，抑制了細胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力。FCM結(jié)果顯示，SCJ藥物處理后，MDA-MB-231和MCF-7細胞均發(fā)生G2期阻滯。Western blot結(jié)果顯示，SCJ藥物處理后，MD

7、A-MB-231和MCF-7細胞的Cyclin D1、Cyclin B1及Bcl-2蛋白表達均發(fā)生了下調(diào)，而E-Cadherin蛋白表達升高。相比同濃度的環(huán)巴胺，SCJ-26和SCJ-43對MDA-MB-231和MCF-7細胞的藥物作用更強，且隨著SCJ藥物濃度變化，存在濃度-效應(yīng)關(guān)系。
　　第二部分 SCJ對乳腺癌細胞輻射敏感性影響及機制的研究
　　目的：
　　研究SCJ-26和SCJ-43對乳腺癌細胞MDA-MB-

8、231及MCF-7輻射敏感性方面的實驗，并對其機制進行初步探討。
　　方法：
　　對經(jīng)不同濃度SCJ-26和SCJ-43處理后的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7細胞應(yīng)用不同劑量的c射線照射后，進行克隆形成實驗，觀察SCJ藥物對乳腺癌細胞放射敏感性的影響。應(yīng)用流式細胞術(shù)觀察 SCJ藥物對乳腺癌細胞 MDA-MB-231及MCF-7受照后細胞周期變化的影響。應(yīng)用Western blot檢測SCJ藥物對兩種乳腺癌細胞受照后周

9、期相關(guān)蛋白和輻射相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　MDA-MB-231和MCF-7兩種細胞均觀察到，和對照組、單加SCJ-26或SCJ-43組及單照射組相比，SCJ藥物處理+照射組的細胞存活曲線明顯降低，G0/G1期和G2/M期細胞比例升高，且有明顯的sub G1峰。凋亡相關(guān)蛋白Bax蛋白表達增高，周期相關(guān)蛋白Cyclin D1蛋白表達降低；輻射相關(guān)蛋白XRCC1蛋白、Ku-70蛋白和FEN-1蛋白表達均下調(diào)。隨著SCJ-2

10、6和SCJ-43濃度升高，上述變化更為明顯，存在一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系。相比同濃度的環(huán)巴胺， SCJ-26和 SCJ-43對MDA-MB-231和MCF-7兩種細胞經(jīng)c射線照射后的抑制作用更強。
　　第三部分 SCJ對乳腺癌裸鼠異種移植瘤生長和轉(zhuǎn)移影響的研究
　　目的：
　　通過建立乳腺癌MDA-MB-231細胞的裸鼠移植瘤模型，觀察SCJ-26和SCJ-43對乳腺癌細胞在裸鼠的局部成瘤性及遠處轉(zhuǎn)移能力的影響。
　

11、　方法：
　　將乳腺癌MDA-MB-231細胞懸液接種于BALB/c雌性裸鼠腋下乳房脂肪墊，建立裸鼠移植瘤模型，同時分設(shè)對照組及不同濃度 SCJ藥物處理組。藥物處理組按組每日灌胃喂飼相應(yīng)濃度的SCJ藥物，觀察移植瘤形成率，觀察腫瘤生長速率，定期測量腫瘤大??；4周后處死實驗裸鼠，觀察裸鼠肺臟和肝臟的遠處轉(zhuǎn)移情況。將乳腺癌MDA-MB-231細胞通過尾靜脈注射，建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型，并設(shè)對照組及不同濃度SCJ-26和SCJ-43藥物處理

12、組，觀察SCJ藥物處理組對乳腺癌細胞在裸鼠形成肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)能力的影響。
　　結(jié)果：
　　通過BALB/c雌性裸鼠乳房接種乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞，成功建立了裸鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤模型。與無藥物處理裸鼠的對照組相比，SCJ-26和SCJ-43各濃度處理組兩種乳腺癌細胞局部出瘤率明顯下降，且腫瘤大小和體積均明顯減小。隨著SCJ濃度升高，裸鼠出瘤率和腫瘤大小均減少，二者存在一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系。MDA-MB-231細胞原

13、位種植肝轉(zhuǎn)移只發(fā)生在空白裸鼠對照組（2/6），其余組未發(fā)現(xiàn)。通過裸鼠尾部靜脈注射MDA-MB-231細胞，成功建立了裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。與空白裸鼠組相對照，SCJ-26或SCJ-43各濃度處理組裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移明顯減少，轉(zhuǎn)移的平均肺結(jié)節(jié)數(shù)也明顯減少。隨著 SCJ濃度升高，肺結(jié)節(jié)數(shù)量逐漸減少，二者存在濃度-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論
　　(1) SCJ-26和SCJ-43在體外可以抑制乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖能力、

14、貼壁能力、遷移和轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致兩種乳腺癌細胞細胞周期G2/M期阻滯，機制可能與其下調(diào)Cyclin D1、Cyclin B1及Bcl-2蛋白，上調(diào)E-Cadherin蛋白有關(guān)。在相同濃度下，SCJ-26和SCJ-43兩種藥物的抗腫瘤作用明顯優(yōu)于環(huán)巴胺。
　　(2)在無影響細胞生長的低濃度下，SCJ-26和 SCJ-43藥物可以明顯增加乳腺癌細胞的放射敏感性，其機制可能與上調(diào) Bax基因促進受照后細胞凋亡，下調(diào)Cyclin B1蛋白使

15、細胞發(fā)生G2期阻滯，同時輻射損傷修復(fù)相關(guān)蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白下調(diào)有關(guān)。同樣，SCJ-26和SCJ-43增加乳腺癌細胞對射線敏感性的作用療效明顯強于環(huán)巴胺。
　　(3)在動物體內(nèi)試驗，SCJ-26和SCJ-43都可以降低乳腺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤率，同時降低了移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長速度。SCJ-26和 SCJ-43可以抑制MDA-MB-231細胞的體內(nèi)的遠處轉(zhuǎn)移能力。SCJ-26和 SCJ-43的體內(nèi)抗