非折疊蛋白反應(yīng)對乳腺癌細胞化療敏感性的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1、研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激對人乳腺癌細胞的毒性效應(yīng)。
  2、探討ER應(yīng)激引致非折疊蛋白反應(yīng)(unfloded protein response, UPR)的激活對MEK/ERK生存信號通路的影響。
  3、檢測DNA損傷藥物和靶向微管藥物是否激活ER應(yīng)激。
  4、研究SiRNA敲減GRP78和抑制MEK/ERK通路對乳腺癌細胞化療敏感性的影響。

2、  方法:
  1、隨機選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2006-2008年間住院病人的乳腺癌術(shù)后組織標(biāo)本50例,以正常乳腺組織標(biāo)本20例做對照,用免疫組化法檢測乳腺癌組織及正常組織中GRP78的表達。
  2、以乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3為研究對象,用不同濃度(0、1.5、3、6、9和12μmol/L)衣霉素(Tunicamycin, TM)處理,溴化丙啶(propidium iodide, PI

3、)染色,流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率;
  3、以乳腺癌細胞MDA-MB-231、SK-BR-3為研究對象,MEK抑制劑U0126預(yù)處理1h后,再同上處理細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
  4、Western blotting檢測正常培養(yǎng)細胞株HUVEC、WI-38及乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3中GRP78的表達;用TM不同時間(0、6、12、24和36h)處理細胞,Western bl

4、otting檢測GRP78的表達;同時用Western blotting檢測MEK/ERK通路ERK1/2、pERK1/2的表達。
  5、MEK抑制劑U0126預(yù)處理MDA-MB-231、SK-BR-3細胞,然后給予TM處理,用RT-PCR法檢測GRP78mRNA的表達。
  6、細胞毒類藥物(順鉑,阿霉素)和靶向微管藥物(多西紫杉醇,長春瑞濱)處理MDA-MB-231、SK-BR-3細胞,Western blotting

5、檢測GRP78的表達。
  7、MEK抑制劑U0126預(yù)處理細胞1h后,再用化療藥物處理細胞,檢測凋亡率,觀察應(yīng)用U0126前后凋亡率的變化。
  8、SiRNA轉(zhuǎn)染敲減GRP78的表達,檢測TM和化療藥物誘導(dǎo)凋亡率的改變。
  結(jié)果:
  一、誘導(dǎo)ER應(yīng)激對乳腺癌細胞GRP78表達和細胞凋亡的影響。
  1、免疫組化結(jié)果顯示,GRP78在乳腺癌組織中強陽性表達;Western blotting結(jié)果顯示在乳

6、腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231及SK-BR-3中GRP78亦呈強陽性表達,而在正常細胞株中,表達較弱。三株乳腺癌細胞中 GRP78表達分別與正常細胞株比較,差異顯著(P<0.01)。
  2、乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3對TM誘導(dǎo)的細胞凋亡不敏感,凋亡率均小于30%,但是TM可以誘導(dǎo)正常細胞出現(xiàn)有意義的凋亡。
  3、TM誘導(dǎo)三株乳腺癌細胞GRP78表達明顯上調(diào),與對照組比較,有顯著

7、性差異(P<0.01)。
  二、干擾MEK/ERK通路對乳腺癌細胞GRP78表達和凋亡的影響
  1、ERK1/2在乳腺癌 MDA-MB-231、SK-BR-3細胞中被激活,TM誘導(dǎo) ERK1/2的進一步激活(P<0.01)。
  2、U0126可以下調(diào)GRP78蛋白的表達(P<0.05),并且阻斷TM對GRP78的上調(diào)作用;同時,無論有無 TM時,U0126均下調(diào) GRP78mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。

8、r>  3、U0126增加TM誘導(dǎo)細胞凋亡率,與對照組比較,有顯著性差異(P<0.01)。
  4、GRP78 SiRNA轉(zhuǎn)染增加TM和U0126誘導(dǎo)的細胞凋亡率,與對照組比較,有顯著差異(P<0.01)。
  三、靶向GRP78對DNA損傷藥物誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡的增敏作用
  1、長春瑞濱(Vinorelbine, VIN)和多西紫杉醇(Docetaxel, DOC)對GRP78表達無顯著影響(P>0.05);順鉑

9、(Cisplatin, CDDP)、阿霉素(Adriamycin, ADM)上調(diào)GRP78的表達(P<0.05)。
  2、U0126通過抑制MEK通路增加CDDP和ADM誘導(dǎo)的細胞凋亡(P<0.01)。
  3、GRP78 SiRNA轉(zhuǎn)染增加CDDP和ADM誘導(dǎo)的細胞凋亡(P<0.01)。
  結(jié)論:
  本研究結(jié)果證明:
  1、UPR的激活是乳腺癌適應(yīng)腫瘤應(yīng)激環(huán)境并對 ER應(yīng)激致細胞凋亡作用耐受的原因

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