羅格列酮對OLETF鼠糖尿病發(fā)病的干預(yù)及作用機(jī)制的研究——羅格列酮對OLETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、【背景】糖尿病發(fā)病率逐年上升，成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大嚴(yán)重危害人類健康的疾病。全球目前有超過1.5億糖尿病患者，預(yù)測到2025年這一數(shù)字將會翻一番。近年來，盡管在糖尿病治療領(lǐng)域取得了不斷的進(jìn)步，但臨床上仍然缺乏有效的手段控制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與進(jìn)展。預(yù)防糖尿病的發(fā)生，從根本上消除糖尿病帶來的危害，成為最受人們關(guān)注的問題之一。 在全部糖尿病患者中，90％以上是2型糖尿病患者。幾乎所有2型糖尿病都要經(jīng)過糖耐量異常(im

2、pairedglucosetolerance，IGT)階段。IGT是介于正常和2型糖尿病的過渡階段。目前認(rèn)為，IGT患者經(jīng)過合理的干預(yù)治療，有相當(dāng)部分患者可使餐后2小時血糖恢復(fù)到正常水平，但如果不進(jìn)行干預(yù)治療，則每年以10％～15％的自然轉(zhuǎn)歸率發(fā)展為2型糖尿病。目前國內(nèi)外普遍認(rèn)為，對IGT人群進(jìn)行干預(yù)，是預(yù)防2型糖尿病發(fā)生的最有針對性和經(jīng)費(fèi)開支最合理的人群。 研究表明，占人類糖尿病患者90％以上的2型糖尿病是可以預(yù)防的，且有效的

3、干預(yù)可以降低2型糖尿病發(fā)病危險31％～58％。 藥物干預(yù)是目前糖尿病預(yù)防的重要手段之一。目前2型糖尿病的干預(yù)藥物主要包括二甲雙胍、α-糖苷酶抑制劑和胰島素增敏劑。其中TRIPOD和DPP研究顯示，胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物(TZDs)不僅能預(yù)防糖尿病的發(fā)生，而且與其它干預(yù)藥物相比，能更有效地降低2型糖尿病的發(fā)生率。以TZDs羅格列酮(rosiglitazone)為研究對象之一的大規(guī)模前瞻性糖尿病預(yù)防研究(DREAM)也已經(jīng)進(jìn)行

4、。這表明，TZDs可能是一類非常有前途的糖尿病干預(yù)藥物。羅格列酮作為TZDs中新開發(fā)的一種副作用較小的藥物，在2型糖尿病干預(yù)中可能發(fā)揮更重要的作用。闡明羅格列酮預(yù)防糖尿病的機(jī)制對更好地利用TZDs尤其是羅格列酮進(jìn)行糖尿病的防治工作是非常必要的。 2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為胰島β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗是2型糖尿病最重要的兩個發(fā)病因素。胰島β細(xì)胞功能受損作為兩個重要的發(fā)病環(huán)節(jié)之一，在近年來受到越來越多的重視，甚至有

5、觀點(diǎn)認(rèn)為胰島β細(xì)胞功能受損相對于胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)病過程中可能起著更為重要的作用。英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS)顯示，β細(xì)胞功能受損可以導(dǎo)致2型糖尿病患者血糖控制上的惡化。既往研究表明，細(xì)胞凋亡是2型糖尿病β細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因，凋亡引起的胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少足以導(dǎo)致高血糖。 本研究將采用目前國際上公認(rèn)的優(yōu)秀自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF(OtsukaLong-EvansTokushimaFatty)鼠及其同系

6、非糖尿病對照鼠LETO(Long-EvansTokushimaOtsuka)鼠作為研究對象，用羅格列酮進(jìn)行干預(yù)，觀察該藥對2型糖尿病的預(yù)防作用，并探討羅格列酮對胰島β細(xì)胞凋亡的作用與可能機(jī)制。 研究分以下二部分進(jìn)行： 第一章羅格列酮對OLETF鼠糖尿病發(fā)病的干預(yù)作用 【目的】探討羅格列酮對自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠糖尿病發(fā)病的干預(yù)作用。 【方法】1.以自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系

7、非糖尿病對照鼠LETO鼠為實(shí)驗(yàn)對象。大鼠皆為雄性，共分三組。OLETF鼠羅格列酮干預(yù)組(干預(yù)組)和OLETF鼠對照組(對照組)，每組20只；LETO鼠10只作為正常對照組(LETO組)。從8周齡開始，干預(yù)組予羅格列酮溶液灌胃(3mg·kg-1d-1)，其余兩組以等量蒸餾水灌胃。 2.定期行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。試驗(yàn)前隔夜禁食15小時、不禁水，按2g/kg予30％葡萄糖溶液灌胃。 3.監(jiān)測各組大鼠攝食及體重增長情

8、況，每周稱量大鼠體重和攝食量一次。 Ⅲ4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。多組間資料比較用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)。糖尿病發(fā)病率組間比較用X2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α定為0.05。 【結(jié)果】1.干預(yù)組和對照組攝食量各周齡均顯著高于LETO組(p＜0.01)。干預(yù)組攝食量與對照組相比在各周齡均無顯著性差異(p＞0.05)。 2.23周

9、齡對照組負(fù)荷后2h血糖(2hPG)較前升高(10.1±1.8mmol/L)，顯著高于13周齡和18周齡血糖(8.2±0.9，6.7±0.9mmol/L)(p＜0.01)，并隨周齡進(jìn)一步升高(40周齡14.8±3.2mmol/L)。 3.對照組在23周齡出現(xiàn)4例糖耐量異常、1例糖尿病。40周齡時，糖尿病發(fā)病率為92.9％；干預(yù)組在30周齡有1例糖耐量異常，40周齡時糖尿病發(fā)病率為6.7％。干預(yù)組的發(fā)病率顯著低于同時期對照組(p＜0

10、.01)。LETO組無IGT或糖尿病發(fā)生。 4.干預(yù)組血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素顯著低于對照組(p＜0.05)。 【結(jié)論】 1.羅格列酮能夠顯著降低OLETF鼠血糖升高程度，延緩高血糖的出現(xiàn)； 2.羅格列酮可顯著降低OLETF鼠2型糖尿病的發(fā)病率，有效預(yù)防糖尿病的發(fā)生； 3.羅格列酮能夠顯著降低血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素水平。 第二章羅格列酮對O

11、LETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響 【目的】通過對羅格列酮干預(yù)的OLETF鼠及其對照組胰島β細(xì)胞凋亡水平和凋亡相關(guān)因素的觀察，對羅格列酮抑制胰島β細(xì)胞凋亡的作用和可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。 【方法】1.分別于8、32和40周齡隨機(jī)處死大鼠。大鼠宰殺后分離胰腺，濾紙吸干水份稱重?？v向分離并分置于4％多聚甲醛、液氮和3％戊二醛中待檢。 2.以石蠟切片機(jī)間隔4μm連續(xù)切片。相鄰切片分別用標(biāo)準(zhǔn)HE染色觀察組織學(xué)改變、用免疫組化標(biāo)

12、記胰島β細(xì)胞、TUNEL+免疫組化法標(biāo)記凋亡的胰島β細(xì)胞，免疫組化法染色Bcl-2陽性細(xì)胞。同時計(jì)算凋亡的β細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。每只鼠至少計(jì)數(shù)20個胰島。凋亡的β細(xì)胞百分?jǐn)?shù)=(凋亡β細(xì)胞數(shù)/總β細(xì)胞數(shù))×100％。 3.記數(shù)Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)：免疫組化切片中，細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈棕黃色至深棕黃色者為陽性細(xì)胞。肉眼計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，每只鼠至少計(jì)數(shù)20個胰島，并計(jì)算陽性率。陽性率=(陽性細(xì)胞數(shù)/總β細(xì)胞數(shù))×100％。 4.電子顯微鏡觀

13、察胰島β細(xì)胞形態(tài)。 5.取液氮中的胰腺標(biāo)本，提取總RNA，以半定量RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax，凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，檢測各條帶輝度，并計(jì)算特異條帶與內(nèi)參照GAPDH條帶的輝度比值。觀察其在基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異。 Ⅴ6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 【結(jié)果】1.各組大鼠胰腺重量隨周齡延長有逐漸增加的趨勢。但不同周齡大鼠

14、自身比較及相同周齡各組大鼠間胰腺重量均無顯著性差異(P＞0.05)。各組8周齡和32周齡胰腺/體重％無顯著性差異(p＞0.05)，40周齡LETO組顯著高于干預(yù)組和對照組(p＜0.01)。 2.8周齡時各組大鼠胰島結(jié)構(gòu)無明顯差別。32周齡，干預(yù)組和對照組胰島與LETO組相比明顯肥大，有纖維組織長入。對照組大鼠胰島纖維化更嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)不整齊。40周齡時，對照組大鼠胰島形狀更不規(guī)則，纖維組織大量增生，多數(shù)胰島失去正常結(jié)構(gòu)，可見胰島明顯

15、萎縮。干預(yù)組大鼠胰島仍保留基本形態(tài)，無明顯萎縮。部分胰島有腺泡侵入或有明顯的纖維化。 3.電鏡下可見對照組凋亡的胰島β細(xì)胞染色質(zhì)邊集、胞核縮小濃染，出現(xiàn)核固縮。胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器萎縮、分泌顆粒數(shù)量減少。干預(yù)組非凋亡的胰島β細(xì)胞可見細(xì)胞器腫脹。 4.LETO組胰島β細(xì)胞凋亡率在8、32、40周齡分別為0.08±0.03％、0.12±0.03％、0.12±0.04％；對照組為0.22±0.02％、0.28±0.03％、0.26±0

16、.03％；干預(yù)組32和40周齡為0.18±0.02％、0.17±0.04％。32和40周齡干預(yù)組胰島β細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組(p＜0.01)。 5.LETO組Bcl-2陽性細(xì)胞百分率在8、32、40周齡分別為68.45±21.3％、52.76±12.8％、53.01±11.3％；對照組為50.92±9.4％、36.93±1.4％、33.12±7.1％；干預(yù)組32周齡和40周齡為59.60±9.9％、55.24±9.7％。

17、 6.各組Bcl-2mRNA表達(dá)水平都隨周齡增加而降低，但這種變化無顯著性差異Ⅵ(p＞0.05)。同周齡各組間的橫向比較，在32周齡LETO組表達(dá)水平最高，干預(yù)組次之，對照組最低，但差異不具有顯著性(p＞0.05)。 【結(jié)論】1.OLETF鼠胰島β細(xì)胞在糖尿病發(fā)生前即有高水平凋亡出現(xiàn)，隨病程進(jìn)展，凋亡水平進(jìn)一步增高。 2.羅格列酮能顯著降低胰島β細(xì)胞凋亡水平，保護(hù)胰島的正常結(jié)構(gòu)和功能，這可能是其延緩、預(yù)防糖尿病發(fā)生的機(jī)