三類新型集成化的基因芯片及其相關(guān)儀器的研制.pdf

1、基因芯片技術(shù)是一種高通量的現(xiàn)代生物檢測技術(shù)，在功能基因研究、新藥篩選、疾病的基因診斷等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用?；蛐酒瑱z測是一個復(fù)雜的過程，包括：靶基因的擴增、擴增產(chǎn)物的標記、芯片雜交與清洗、雜交信號檢測及分析等。在這樣的一個復(fù)雜檢測流程中，容易產(chǎn)生由于操作過程的復(fù)雜性而帶來的檢測結(jié)果不穩(wěn)定，從而影響了基因芯片的推廣應(yīng)川。我們研制基因擴增雜交一體化檢測儀的目的是為了實現(xiàn)從基因擴增、熒光標記、雜交與清洗、芯片信號檢洲的一系列流程的自動化操作，

2、以減少檢測結(jié)果的人為兇素的干擾，提高基因芯片在基因多態(tài)性分析及疾病診斷等方面的應(yīng)用水平。為了進一步簡化基因擴增雜交榆測一體化芯片結(jié)構(gòu)及其儀器的復(fù)雜性，我們義提出了管蓋基兇芯片。為能夠?qū)Χ鄠€靶基因?qū)崿F(xiàn)定量檢測，我們在本實驗室提出的TaqMan微陣列芯片的基礎(chǔ)上，設(shè)計和研制了定量基兇芯片檢測系統(tǒng)，并設(shè)計了一種新的FRET定量柃測基因芯片，可用于同一樣品中不同基因的高通量定量檢測。 基因擴增雜交一體化芯片及檢測系統(tǒng)針對基因芯片檢測過程

3、的復(fù)雜性，我們設(shè)計了集成化的操作平臺-基因擴增雜交檢測一體化芯片，用于實現(xiàn)基因擴增、雜交、清洗、檢測的自動化以減少復(fù)雜操作過程中的人為因素影響。基因擴增雜交檢測一體化芯片的結(jié)構(gòu)包括二個功能區(qū)域：十四個通道的玻璃毛細管作為基因擴增區(qū)域和由十四個在玻片上同定了核酸探針陣列的基因芯片組成的雜交檢測區(qū)。使用了硅膠作為密封件，分別將二個區(qū)域相連。該芯片可實現(xiàn)十四個通道的基因擴增與基因芯片檢測一體化，檢測樣品流程所需要的時間為3～4小時。

4、基于上述牛物芯片，我們設(shè)計和研制了基因擴增雜交一體化檢測儀，能夠進行PCR、生物芯片雜交和熒光榆測的。體化操作?；驍U增雜交一體化檢測儀主要由溫度精確控制系統(tǒng)、樣品自動注入系統(tǒng)和熒光榆測幾部分組成，包括：計算機、加熱爐、熒光顯微鏡、溫度控制器、試樣裝夾及送進機構(gòu)、運動控制箱、清洗機構(gòu)等。與南京依科機電有限公司合作開發(fā)出相應(yīng)的產(chǎn)品，通過了江蘇省醫(yī)療器械檢測所的檢驗，建立了醫(yī)療器械注冊產(chǎn)品標準。該儀器有如下的結(jié)構(gòu)特點： 雜交過程的溫

5、度控制通過空氣介導(dǎo)的溫控體系來實現(xiàn)。具有變溫快、溫度場均勻等優(yōu)點。此儀器能夠?qū)CR反應(yīng)區(qū)的溫度進行精確控制，其溫度上升的速率可達劍20℃/s，下降的速率可達到10℃/s。 芯片的熒光雜交信號檢測是通過熒光顯微鏡與CCD的圖像采集技術(shù)實現(xiàn)的。芯片被固定存維移動平臺上在顯微鏡下進行熒光信號的掃描閱讀，在PC機上顯示，存入計算機?；∩鲜鲂酒蛢x器，我們發(fā)展了用于乙型肝炎基因突變檢測的試劑，可以對乙型肝炎YMD突變基因進行檢測，并在

6、南京市第二醫(yī)院進行了臨床檢測，檢測準確率達劍100﹪。通過與在普通玻片瓊脂糖基膜上固定了用于檢測YMDD突變的分子信標探針芯片的檢測結(jié)果進行比較，得到了相似的雜交檢測信號。結(jié)果表明，這種新型的生物芯片可以滿足臨床檢測的需求。管蓋基因芯片及檢測系統(tǒng)為進一步簡化上述基因擴增雜交檢測一體化芯片的復(fù)雜性，我們提出了直接在Eppendorf管內(nèi)完成基因芯片的基因擴增雜交檢測的新方案一管蓋基因芯片技術(shù)。管蓋基因芯片是一個基因擴增到雜交檢測的全封閉器

7、件，基因探針同定存特制的基因擴增管的管蓋內(nèi)表面，并在這個封閉的體系中加入了一個雜交液貯液池。研究結(jié)果表明，管蓋基因芯片能夠成功地在一個仝封閉且無清洗的基因芯片體系內(nèi)實現(xiàn)多重基因擴增、芯片雜交及雜交信號的熒光檢測過程，而且能夠有效地避免了不同樣品間摹兇擴增產(chǎn)物的無交叉污染。 我們設(shè)計和研制了相應(yīng)的管蓋因芯片檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)包括熒光顯微鏡與CCD等硬件，以及相關(guān)圖像分析和數(shù)據(jù)處理軟件。該軟件可對雜交結(jié)果進行圖像捕獲、貯存并進行圖像

8、分析、雜交強度計算、檢測結(jié)果標準化與數(shù)字化。 在管蓋基因芯片研究的基礎(chǔ)上，我們設(shè)計和研制了可同時檢測SARS、副流感I、腸病毒、風疹、副流感Ⅲ、流感B、麻疹、RSV、鼻病毒、流感 A 等 10 種病毒的管蓋基因芯片，用于檢測引起流感類似癥狀的主要病原體，以期對于SARA-CoV感染與流感等具有相似的早期臨床癥狀的病人進行早期的鑒別。研制出可進行臨床使用的檢測試劑盒。在上述九種病原體的檢測管蓋基因芯片的基礎(chǔ)上，把實驗結(jié)果重現(xiàn)性最穩(wěn)

9、定的五種病毒檢測探針(SARS、副流感I、腸病毒、風疹、流感A)制備檢測試劑盒產(chǎn)品，其中一種風疹病毒探針的作為內(nèi)控陽性指標，用以監(jiān)測檢測過程的有效性，減少假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。制定了檢測試劑盒的企業(yè)標準、生產(chǎn)檢定標準、試劑使用說明書。該產(chǎn)品通過了國家生物制品檢定所的檢定。 我們開展了用于單堿基錯配檢測的管蓋基因芯片的研究。以HlV-1病毒的耐藥基因突變作為檢測對象，我們在管蓋基因芯片的基礎(chǔ)上設(shè)計了一用于檢測基因突變的管蓋基因芯片。實

10、現(xiàn)了HIV-1病毒的抗藥性相關(guān)位點K65R．K103N，V106A．V1081，Y181C．Y184M和Y188C的單堿基錯配的檢測。 定量基因芯片掃描系統(tǒng)及FRET定量檢測基因芯片基因芯片是一種高通量的基因檢測技術(shù)，而定量PCR是一種基因定量檢測技術(shù)，兩者的有機結(jié)合將可進行多基因的定量研究與應(yīng)用。最近，我們實驗室發(fā)展了一種基于同定Taqman探針技術(shù)的定量基因芯片。在此基礎(chǔ)上，本論文設(shè)計和研制了定量基因芯片檢測系統(tǒng)，提出了一種

11、多基因同時定量檢測的技術(shù)平臺，可用于同一樣品中不同基因的高通量定量檢測。我們研制的基于基因芯片的實時定量基因芯片掃描儀，包括硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)。硬件系統(tǒng)有光學(xué)系統(tǒng)、基因芯片掃描平臺和信號采集、信號傳遞系統(tǒng)溫控平臺等5個部分組成。軟件系統(tǒng)分為溫度控制、圖像定位、掃描控制、光源控制、信號處理、圖像處理、結(jié)果計算7個子系統(tǒng)。該系統(tǒng)基本達到了基因芯片適時定量檢測的要求。為了驗證定量基因芯片掃描系統(tǒng)，對固定FRET探針的FRET定量檢測基因芯片進