線蟲動(dòng)態(tài)光學(xué)成像分析的集成化微流控芯片研究.pdf

1、簡單多細(xì)胞生物的活體光學(xué)成像分析，以非侵入方式獲取生物真實(shí)生理信息，提供可視化數(shù)據(jù)進(jìn)而指導(dǎo)復(fù)雜生物系統(tǒng)的研究。秀麗隱桿線蟲以其培養(yǎng)簡單、遺傳穩(wěn)定和進(jìn)化保守等優(yōu)勢(shì)，迅速成為生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱門模型，而線蟲通體透明的特性，使其進(jìn)行光學(xué)成像成為可能。
　　線蟲活體光學(xué)成像分析面臨的挑戰(zhàn)在于：亟需建立有效平臺(tái)，靈活操縱這些微小的生物個(gè)體，給以精確可控的環(huán)境信息，并輸出高分辨的成像結(jié)果。傳統(tǒng)手段采用麻醉劑固定線蟲，以獲取高質(zhì)量成像信息，由于

2、線蟲處于非清醒狀態(tài)，其神經(jīng)活動(dòng)的結(jié)果可靠性受到質(zhì)疑。微流控生物芯片，憑借精確的流體操控力、良好的生物兼容性和光學(xué)透明性，極大降低了傳統(tǒng)手段對(duì)生物體的損傷，突破時(shí)間和空間精度的限制，同時(shí)提高了分析通量。本文以模式生物秀麗隱桿線蟲為研究對(duì)象，建立基于微流控芯片的刺激平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)活體動(dòng)態(tài)光學(xué)成像分析，探究細(xì)胞或基因如何應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的擾動(dòng)，主要研究結(jié)果如下：
　　首先，本文提出了一種“氣體芯片”，用于研究生物應(yīng)對(duì)氣態(tài)化學(xué)刺激的神經(jīng)元響應(yīng)。借

3、助梳狀薄膜閥高效固定線蟲身體，同時(shí)以液-氣層流切換的方式將氣體刺激物準(zhǔn)確輸送至線蟲頭部。通過基因編碼的鈣指示蛋白 G-CaMP實(shí)時(shí)追蹤神經(jīng)元活動(dòng)，成功監(jiān)測(cè)到非極性氣體O2誘導(dǎo)的URX神經(jīng)元鈣信號(hào)，以及高濃度CO2氣體對(duì)神經(jīng)元的抑制現(xiàn)象。進(jìn)一步，通過輸出極性氣體刺激，首次記錄到ASH神經(jīng)元對(duì)揮發(fā)性氣體辛醇的動(dòng)態(tài)響應(yīng)，并對(duì)比了不同突變株系的鈣波信號(hào)差異。
　　為在更加精細(xì)的時(shí)間尺度上探究神經(jīng)元的時(shí)間響應(yīng)特性，本文以“氣體芯片”為基礎(chǔ)發(fā)

4、展了一種“可控分段流芯片”。通過程序控制芯片薄膜閥與流體，交替輸出時(shí)間可控的氣流與液流，氣態(tài)化合物輸出精度可達(dá)亞秒級(jí)（0.1 s）。借助芯片輸出21％的氧氣脈沖，發(fā)現(xiàn)URX神經(jīng)元對(duì)持續(xù)時(shí)間大于0.5 s的刺激敏感。輸出重復(fù)刺激，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元在短脈沖（1 s）刺激下能快速恢復(fù)，而延長刺激時(shí)間（10 s），則出現(xiàn)信號(hào)逐級(jí)降低的神經(jīng)元適應(yīng)性。
　　將“分段流芯片”進(jìn)一步擴(kuò)展至揮發(fā)性氣味與氣壓機(jī)械應(yīng)力的刺激輸出研究中，初步探索了線蟲的嗅覺神

5、經(jīng)元AWC與傷害感受神經(jīng)元ASH的應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果表明，AWC神經(jīng)元不僅參與了對(duì)氣味撤去的感知，還能同時(shí)響應(yīng)流體壓力變化。另一方面，輸送高壓強(qiáng)的氣流至線蟲頭部并形成包裹，監(jiān)測(cè)到鼻尖碰觸敏感的ASH神經(jīng)元響應(yīng)，提示此方法或能實(shí)現(xiàn)有效的機(jī)械碰觸刺激。
　　線蟲能在數(shù)秒內(nèi)通過嗅覺神經(jīng)感知病原菌氣味，卻通常需要數(shù)小時(shí)啟動(dòng)免疫響應(yīng)。借助熒光標(biāo)記手段，能直觀顯示相關(guān)免疫基因表達(dá)。為監(jiān)測(cè)單個(gè)線蟲的免疫動(dòng)態(tài)過程，本文發(fā)展了以腔室陣列培養(yǎng)和微閥固定為

6、核心的集成化微流控芯片，模擬線蟲-病原菌共生環(huán)境。以銅綠假單胞菌 PA14侵染線蟲為模型，通過高效固定采集成像數(shù)據(jù)，并定量其腸部免疫基因irg-1表達(dá)變化。食物種類與濃度的變化，影響irg-1免疫表達(dá)的進(jìn)程。此外，加入不同濃度藥物，研究了線蟲感染后的恢復(fù)。該方法為研究線蟲先天性免疫、以及基于線蟲模型的藥物篩選提供高效研究平臺(tái)。
　　綜上所述，本文借助集成化微流控芯片實(shí)現(xiàn)了良好的線蟲固定，并輸出多種模式的刺激，研究活體線蟲細(xì)胞內(nèi)分子